第八章 分子育种

第八章分子育种一、分子育种的概念与程序概念

按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组技术和DNA转移技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在短时间内趣于完善，以创造出新的生物类型的技术体系，亦即基因工程。2.植物基因工程

植物基因工程是近20年来随着DNA重组技术、植物遗传转化技术及植物组织培养技术而发展起来的现代生物技术。3.基因工程的基本步骤目的基因的获取基因载体的选择与构建目的基因与载体的拼接重组子导入受体分子外源基因的表达和产物的分离重组子的检测4.观赏植物基因工程的目的基因1、观赏性开花、花色、花型、花径相关基因。2、抗逆性抗虫、抗旱、耐盐碱、抗寒相关基因3、切花寿命4、花期调控二、基本技术及原理（一）DNA重组技术将外源DNA片段与载体分子连接，形成重组DNA分子，再将重组子导入寄主细胞内。这一技术体系称为DNA重组技术。DNA

重

组

技

术（二）基因工程的基本概念1.转化（Transformation)：是指将外源DNA导入受体细胞的过程。2.复制子（Replicon)：具有一个复制起点(ori)的DNA分子称为一个复制子。3.载体（Vector）：能与外源DNA连接并实现转化的复制子。4.重组子（Recombinant）：连接了外源DNA分子的复制子。（三）基因工程的工具酶限制性内切酶（restrictionendonuclease)DNA连接酶（ligase)末端修饰酶（五）基因工程的载体系统1、质粒载体2、噬菌体载体3、病毒载体质粒图谱及质粒构建启动子外源基因终止子启动子报告基因终止子

（标记基因）

目的片段选择标记

载体(六)植物基因工程的报告基因定义特点在选择培养基上生长报告基因与目的基因嵌和表达研究调控区报告基因的种类新霉素磷酸转移酶（Neomycinephosphotransferase–II,NPTII)基因氯霉素乙酰基转移酶（Chloraphenicolacetyltransferase,CAT）基因潮霉素磷酸转移酶（Hygromycinphosphotransferase,Hpt）基因β–

葡萄糖酸苷酶（β–Glucuronidase,GUS）基因荧光素酶（Luceferase,Luc）基因抗除草剂（Basta,Bar）基因三、转基因操作的方法

(一)外源DNA导入植物细胞的方法载体介导的转化方法DNA直接导入法种质系统法外源DNA导入植物细胞的方法1、致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法2、病毒介导的基因转移3、基因枪介导的基因转化4、PEG诱导的基因转化5、脂质体介导6、电激法介导7、超声波介导8、显微注射9、激光微束10、种质系统介导基因转化法1、致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法

含有Ti质粒的致癌农杆菌与一些植物的细胞接触后，Ti质粒的一部分（T-DNA）可以导入植物细胞，整和到植物基因组DNA随其复制。根据这一特性可构建一系列Ti质粒载体，与含目的片段的DNA片段重组，导入致癌农杆菌，再采用叶盘法、原生质体培养法、细胞培养法，通过致癌农杆菌介导进入植物细胞。根瘤农杆菌及Ti质粒Ti质粒根瘤农杆传菌染色体帽外的遗传畜物质，为车共价闭合波环状的DNA分子。Ti质粒的功傲能为农杆直菌提供晌附着于恋植物细典胞壁的着能力；参与寄钞主细胞晃合成激缝素的能稿力；诱发植专物产生完冠瘿瘤法；赋予寄槽主分解恋冠瘿碱期的能力妖；决定寄讨主范围源。Ti质粒的缴结构T-D岁NA区Vir区Con区Ori区Vir区LBRBETi呈Pla下smi音dT-DN狗A区Ori区Con区Vir区操纵测子的基塑因结构姿与功能Vir区是一段鸟长度为35K乏B操纵子包含六个昨基因：Vir塌A、Vir饰B、Vir尽C、VirD、Vir折E、Vir严G。核心区左边界右边界T-DN陵A的结构伯与功能应∶LBRBLBRB植物遗传曲转化的载晋体系统一元载体卷（顺势载捉体）双元载晒体（反浪式载体黄）农杆菌验介导的鼻转化质美粒的构窄建P月G2趣T定N处OSAmprP田G滋1湖T目的基因报告基因，选择标记基因Vir区目的基因报告基因，选择标记基因LBRB农杆菌渔导入方禾法共培养告法叶盘转化盟法整株感染候法原生质体胖共培养法2、基因枪攀介导的转主基因操作基本原仙理操作步甜骤优点影响转化下效率的因寸素Bio碎-Ra离dBiol放isti辆cDS馅-100号0/He抄and龟Hep量taS苗yste晃mBio-盯RadBio乎lis贯tic炸DS梦-10坐00/貌He吊and唱He桐pta煮Sy吃ste钓m操作步骤预培养转基因操松作转基因植属株筛选和监培养转基因植车株的鉴定田间释放影响转化胞效率的因拦素金属微粒DNA沉淀辅折助剂DNA纯度和森浓度微弹速度植物材拉料基因枪法段的优点无宿主伏限制；靶受体叠类型广折泛；可控度荣高；操作简便繁。问题：转化效荷率低；嵌合体多殃；稳定性堤差，瞬凡时表达术；外源基因慰沉默；整合机厚理不详决。3、PEG诱导的制基因转伟化聚乙二于醇（PEG）、多锁聚鸟苷伍酸、磷铁酸钙在周高PH值条件下新诱导原生桂质体扑获DNA分子。步骤：共保温；稀释PEG；非选择诞培养；选择培养理。优点：转化顺利尾，对细胞站伤害小；避免嵌厘合体的竖生成；易于选择蛋；便于进数行理论梅研究；受体广泛鸟。4、脂质睁体介导用化学镜物质将DNA包裹成指球体，产通过植森物原生径质体的兴吞噬作括用，把DNA导入细守胞。5、电激法仁介导利用高压启脉冲作用滴，在原生凯质体上形翼成可逆的宿瞬间通道轧，从而促界进外源DNA的摄取。＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－－6、超声波雄介导7、显微册注射8、激光微姑束9、种质队系统介何导法生物媒体订转化系统(二)转基因夹操作的羞受体系寨统1、高频再寸生体系的络建立愈伤组织煎再生系统直接分浙化再生谎系统原生质体贪再生系统胚状体蓬再生系侍统生殖细禽胞再生均系统2、抗生窑素敏感爽实验抑制细虹菌生长杀死非煌转化细嗓胞3、农杆菌杰敏感实验(三)转化细胞拌的培养和劫转基因植客株的再生恢复生长筛选培养植株再拥生四、转基透因植物的腰鉴定遗传鉴定表达鉴歪定表型分析宇鉴定利用报约告基因Nort手hern杂交West焰ern杂交直接鉴定DNA分子是否阵整合到基驰因组上。1）扩增目塑的片段；2）杂交殿信号鉴密定。（Sout务hern杂交）鉴定步遗骤：筛选鉴定短（利用质绞粒上的选哪择标记）报告基因鹅鉴定（利秋用质粒上泰的报告基胀因）遗传鉴定生长试验

DNA鉴定-southernRNA鉴定-northern蛋白质鉴定-westernSout已hern惭DNA印迹杂碎交植物遗犬传转化帐流程适宜外植货体的选择柜及再生体士系的建立抗生素筛尝选压的确悠定及农杆趁菌菌株的芳选择遗传转化纪操作载体介导蓬的转化铃方法DNA直接导入骗法种质系拔统法选择培养转基因等植株鉴晨定获得再贸生植株转化质绝粒的构会建转基因植粮株的繁殖监与应用利用报告枣基因Sou滔the垮rn杂交Nor很the盆rn杂交West拣ern杂交五、基因勒工程的安秩全性（一）帝安全问覆题的考羡虑工程菌拜株的处宰理转基因附植物的影释放转基因产五品的安全1.转基因作拿物本身成还为杂草；2.转基因作孟物使其亲裂缘野生种厦成为杂草栏或超级杂狸草；3.转基因作绍物可能产烈生新的病铺毒或疾病锦；4.转基因作婆物对非目竭标生物的席危险；5.转基因作弊物作为外融来种对新科生境的入牧侵，使生胀物多样性凯受到威胁终；6.转基因举作物对践生态系鱼统及生秤态过程柿的影响惭；7.其它一些输不可预计险的风险。（二）转掌基因植物赞的风险（三）生驶物安全的幕管理法国为肺对遗传抄修饰生凤物体(GM搬O)的评价槐和立法偿成立了封两个专雨门委员岩会。第一个是鞠遗传工程裳委员会，集成立于197卖5年，任斤务集中肆于实验统室的重零组DNA的研究从；198申6年又成立岂了生物分圣子工程委想员会，它玻的任务是很评价遗传稍修饰生物埋体的大田凡试验、释县放以及商愈品化过程芬的安全问妻题。进入90年代特别描是199糊2年联合国去环境与发的展大会的柿召开，更缸加促进了妄国际上对搞生物安全呜立法工作钓的重视，披特别是大乡丰会由许多蜡国家签署丈的两个纲尊领性文件《21世纪议程》和《生物多牢样性公放约》均在有厅关条款壶中提到胃了生物纷技术安殊全问题改。199亭3年，在尖原国家拐科学技派术委员念会领导将下成立自了国家腾生物遗煌传工程体安全委仰员会，券由来自看卫生部咱、农业醒部、轻脸工业部镰的专家服组成，肤负责医防药、农猜业和轻董工业部假门的生希物安全故。目前，筛在中国蚀负责生仁物安全冶的部门尖有国家灯环保总席局、科挖技部、昼农业部考、卫生判部、国恭家医药医管理局脸、中国惕科学院层和教育钢部等。199晶6年7月10日农业脸部颁布等的《农业生旺物基因宽工程安砖全管理幼实施办极法》是一部较雪完善、较阅好的“实胃施办法”备。农业转基喇因生物安逮全管理条料例中华人民挪共和国国凳务院令忙第304号《农业转基像因生物安暂全管理条污例》已经200既1年5月9