工业微生物菌种保藏技术

第九节工业微生物菌种保藏技术

在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。一、理想的菌种保藏方法应具备的条件(1)

经长期保藏后菌种存活健在；(2)

保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。一、微生物菌种保藏在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本要求：基本方法：生活态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥

由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。

对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。国际重要菌种保藏机构中国菌种保藏单位二、工业微生物菌种保藏技术

(1)超低温或在液氮中冷冻保藏；(2)冷冻干燥或真空干燥保藏；(3)

转接培养或斜面传代保藏；(4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。菌种保藏方法暂时保藏法

斜面传代法穿刺法长期保藏法

液体石蜡法甘油管法砂管保藏法砂土管保藏法滤纸片保藏法冷冻干燥保藏法液氮冷冻法

2.1

冷冻保藏

冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。冷冻保藏种类

一、普通冷冻保藏技术(-20℃)二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)三、液氮冷冻保藏技术

普通冷冻保藏技术(-20℃)将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进行保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。三、液氮冷冻保藏技术

(一)冷冻保护剂

在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。

(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤1．待冷冻保藏菌种悬液的制备(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10％甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。

(2)从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。2．控速冷冻．(1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)；(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃；(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相(-156℃)中保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。(三)卸复苏1．从辫液氮罐固中取出员所需的兵安瓿，输立即置艰于冰浴松中；2．迅速炼将安瓿置粘于37-污40℃水距浴中，并劈燕轻轻摇动范以加速解窄；3．用巴治氏吸管将监安瓿中贮堂存培养物程移接入含痒有2m1厅无菌液体游培养基的狠试管中，扰用同一支夕吸管反复赞抽吸数次先，然后取发0.1-臂0.2m园l(约纽奉4、8滴存)转接入渠琼脂斜面今上。2.2冻干保藏冷冻干督燥的基司本方法演：是通至过在减感压条件扯下使冻嘴结的细地胞悬液牙中的水枕分升华川，使培银养物干晚燥。此法是隶微生物颜菌种长何期保藏涉的最为行有效的工方法之史一。冷冻干燥春过程中必用须使用冷让冻保护剂叙，目前国今内常用脱隐脂乳和蔗距糖，国外僚尚有运用贩动物血清拘等的。大部分愁微生物驳菌种可留以在冻亩干状态似下保藏晒10年感之久而私不丧失物活力。备而且经底冻干后遇的菌株特无需进培行冷冻俱保藏，技便于运析输。培养物递的冻干必过程冷冻真空撑干燥操作四流程安培瓶配制保护剂灭菌菌种培养制备菌悬液分装安培瓶洗净烘干装标签加棉塞预冻真空干燥测定水分熔封管口检查真空度包藏(三)冻匪干菌种的盏保藏与再丈生1．保货藏：冷用冻干燥批后的培屑养物在翼低于5早℃下保防藏。较辽低的保煤藏温度搭(-2绞0～-幻玉70℃堂)对于塘培养物史的长期直稳定更趋好。2．复苏宫：(1)武在超净岭工作台需中用7究0％酒复精棉球背擦洗安环瓿，然懒后用砂煎轮在安书瓿中锉辽一道沟现。(2)用敬无菌纱布联或无菌毛间巾包好安解瓿，然后消用手掰开直安瓿。(3)丢在安瓿咐中加入望0.5穿～1m清l营养疫液体培吸养基，假慢慢旋确转安瓿行，使冻唐干菌种有复水。共然后将填此转接柜到一含兴有再生权培养基骆的无菌暖试管中懒，或直寄接接种庸琼脂斜粮面或涂轧布平板肆。(4)塘在指管认中冻干火的菌种掏通常为培絮粉状残，可以厘将此直内接振落势入盛有常l～2峰ml液锐体培养居基的试员管中，类轻轻振替荡5～置l0m内in，讯然后用半此悬液敏接种适拿宜的再赏生培养易基。2.3拒传代保虹藏将菌种定寻期在新鲜绍琼脂培养抢基上传代泼，然后在货一定的生级长温度下游生长和保刚存的传代络保藏方法仅。可用于怎实验室季中若干进菌种的寺保藏。此法最为省简单和经画济，且不蓝要求任何持特殊的设锅备。但此方法夫易发生培路养基干枯攻、菌体自泽溶、基因画突变。2.3传代培猪养法实验原懂理：保妥藏的菌梯种通过回斜面、搂穿刺或升疱肉培姨养基（舱用于厌氧细夕菌）培步养好后典，置4肆C˚冰翁箱中存吹放，定耳期进行传代柄培养、再妨存放。可用胶塞么代替棉塞月或在斜面哄上覆盖一胖层无菌液火体石蜡来急进一步妥延长保兵存期。操作方法1、斜孤面保藏悲法将菌种转廉接在适宜状固体斜面云培养基上顷，待其充妥分生长后窜，用牛皮记纸将棉塞手部分包扎聪好（棉塞振换成胶塞签效果更好柜），置4尖C˚冰箱穴中包藏。保藏时间栽依微生物坛的种类而各定。霉菌敌、放线菌护及芽孢菌端保存2－庄4个月移策种一次，德酵母菌间分隔两个月周，普通细香菌一个月真，假单胞水菌两周传尾代一次。此法优锹点是操龙作简单随、使用飞方便，怀缺点是置保藏时他间短、肺易被污察染。2、液体峡石蜡保藏须法将无菌苍石蜡加踢在已长迫好菌的控斜面上器，其用伐量以高覆出斜面光顶端1妄CM为割准，使饿菌种与谎空气隔肯绝。将试管直灰立，置低双温或室温背下保存。此法实袄用且效慰果较好巾。霉菌爆、放线饺菌、芽保孢菌可育保藏两亦年以上程，酵母爷菌可保庄藏1－坐2年，宿普通细丹菌也可勒保藏1躬年左右准。3、穿刺烦保藏法按穿刺接尤种方式培另养菌种，健菌种长好灵后用胶塞奸封严，置华4℃冰箱硬存放。矿物油中皇浸没保藏将琼脂斜丘面或液体烫培养物浸含入矿物油堤中于室温螺下保藏，扮此方法简上便有效。可用于丝线状真菌、蓄酵母、细季菌和放线抛菌的保藏道。特别对刊难于冷冻史干燥的丝钱状真菌和离难以在固预体培养基居上形成孢挣子的担子凳菌等的保照藏更为有宿效。浸没保藏订的操作要养点是首先弃让待保藏批菌种在适吨宜的培养野基上生长大，然后注婶入经17定0℃下灭旁菌1-2京h的矿物箩油，矿物早油的用量痰以高出培变养物1c脑m为宜。以液体刚石蜡作口为保藏醋方法时涌，应对考需保藏赵的菌株贝预先作殖试验。拉因为某播些菌株左在液体榨石蜡下振生长还骄十分明桐显，有厘些菌株大如某些悲假丝酵套母还会疫同化液缸体石蜡候，也有欲的对液扮体石蜡贪保藏敏日感。所防有这些作菌株都鸣不能用象液体石矮蜡保藏派。为了朗预防不淡测，一谷般保藏丈株2～顶3年也瘦应做一谜次存活是试验。2.4载体法实验原僵理：使给生长合粱适的微戚生物吸帖附在一乐定的载受体上进塔行干燥婚。常用的载链体有土壤汗、砂土、高硅胶、明干胶、麸皮烂、磁珠和毅滤纸片等。操作方币法（砂壮土管保户藏法）（1）凝河砂处哲理取河砂乘若干加会入盐酸道10%醋，加网热煮沸授30m箩in除敢去有机率机质。碑倒去盐说酸溶液貌，用自故来水冲但洗至中秀性，最闯后一次剪用蒸镏卵水冲洗棍，烘干止后用4熊0目筛兼子过筛进，弃去排粗颗粒升，备用艺。（２）土画壤处理取非耕未作层不甚含腐殖染质的痩昏黄土或智红土，您加自来辉水浸泡馒洗涤数院次，直覆至中性市。烘干狗后碾碎润，用1写00目宏筛子过受筛，粗榨颗粒部多分丢掉侮。(3)砂颜土混合处理妥任当的河枣砂与土举壤按3漂：1的方比例掺养合(或狭根据需响要而用概其他比迟例，甚来至可全僚部作砂狸或土)武均匀后末，装入览10x旧100原mm的座小试管走或安瓿雄管中，弃每管分靠装1g啄左右，沉塞上棉墓塞，进话行灭菌轿(通常哀采用间私歇灭菌单2--醉3次)拴，最后联烘干。2.4基因工程图菌的保藏由载体警质粒等饿携带的控外源D畅NA片疼段通常嗓是遗传咏不稳定帜的、且卧很易丢鹅失其外贤源质粒秃复制子梦。质粒禾基因通对常为宿掌主细胞链生长非凭必需。一般情两况下当溪细胞丢逢失这些车质粒时拨，生长迈速度会巩加快。当培养基豪中加入抗饲生素时，蠢抗生素提沾供了一有视利于携带具质粒的细嫂胞群体的亩极有用的痒生长选择希压。而且度在运用基厉因工程菌必进行发酵梅时，抗生材素的加入宋可帮助维助持质粒复梳制与染色帅体复制的圆协调。我们建议泻基因工程放菌应保藏芹在含低浓增度选择剂卖的培养基仰中。不同菌按种保藏枣方法比复较细菌的保闹藏放线菌菌朱种的保藏保藏方悉法主要侵有：沙土管法纱、冷冻干耀燥法、液录氮冷冻法放线菌惑菌种的圈长期保穗藏依保仅藏放线捧菌的分椅生孢子炎为主要宵方式。2.5槽微范生物活批力和稳妈定性测枣定所有保藏披菌种的方企法都必须控是长期可断靠地保持园菌种的优完良性状不宗变。在保藏袋时定期偷检测菌精种活力蜜，以确糠定保藏猜培养物亚的保藏摧期限和芦保藏方附法的可蒸靠性，练以及确要定在实绵际保藏满过程中欺出现的音细胞死文亡程度怒和遗传菌稳定性屿。对工业微盲生物生产券菌种来说尖，建议保送藏菌种的多形态学和焦生化特征恢(如代谢穷产物的产漠生、酶活闭力、遗传畜特征及生仅化指标)锈应在保藏另后加以检央测和确定汉。加速保袋藏试验聋可用于刑预测保纺藏过程亲中保藏技培养物狗的稳定校性。在脆一给定原温度下风通过对揉高温下甜短期活猜力丧失加程度检六测，可甲以用来俩预测嗜欧酸乳杆顶菌的稳拳定性。成功的侮菌种长叼期保藏疏方法之债有价值植的指标强包括在挑保藏6桌个月、龄1年或秀更长时音间后存挠活百分近率(或基存活单横位)。者细胞群滴体的形资态学特够征或一渴些特别布的生化三特征应亩在菌种辨保藏前叶后保持抛同一性图，以及呈实验室姐中、中筛试车间敌中和生渔产发酵窃中产品馋滴度的糖稳定性序，后者征极为重析要。第十节菌种的衰教退与复壮在生物进脆化的历史者长河中，辜遗传性的国变异是绝捧对的，而清它的稳定僚性反而是软相对的；唇退化性的沃变异是大晚量的，而嗽进化性的圣变异却是乡丰个别的。在自然横情况下喇，个别活的适应惕性变异谋通过自怪然选择伏就可保持存和发充展，最婶后成为到进化的很方向；爽在人为奸条件下饺，人们码也可以授通过人锤工选择佩法去有荒意识地蜜筛选出爷个别的庄正变体征用于生敌产实践齐中。相反，如盗不自觉、发认真地去狭进行人工绢选择，大斤量的自发僚突变菌株盾就会趁机笛泛滥，最肃后导致菌亏种的衰退壁（dege屋nera棵tion）。在长期舅接触菌倡种的实株际工作座人员中暮，都有猎这样的蔽体会，罩即如果福对菌种若工作长摆期放任远自流，产不搞纯艇化、复温壮（r婆eju堵ve-错nat弱ion拍）和育立种，则穴菌种就讽会对你何进行“喝惩罚”亦，反映逮到生产清上就会夜出现持净续的低像产、不泥稳产。队这说明涨菌种的四生产性透状也是神不进则厚退的。菌种衰孝退的表浇现对产量庸性状来吨说，菌卡种的负经变就是室衰退。其他原币有的典码型性状积变得不荐典型时冠，也是隔衰退。绣最易觉先察到的抬是菌落永和细胞嗓形态的波改变。生长速朋度缓慢陡，产孢名子越来虫越少。代谢产物劳生产能力捏或其对宿乳主寄生能厕力的下降律。衰退还表猜现在抗不眯良环境条面件（抗噬丝式菌体、抗融低温等）基能力的减抚弱等。菌种衰愁退的实侧质菌种的糠衰退是叶发生在血细胞群锯体中的千一个由捷量变到膨质变的回逐步演祝变过程烈。开始时，惕在一个大芦群体中仅糖个别细胞熄发生负变糕，这时如传不及时发针现并采取抗有效措施黄，而一味退移种传代随，则群体时中这种负覆变个体的陶比例逐步讨增大，最息后让它们站占了优势简，从而使藏整个群体锅表现出严虽重的衰退源。所以，在石开始时所中谓“纯”阻的菌株，效实际上其鼓中已包含据着一定程出度的不纯侧因素；同穷样，到了猴后来，整钱个菌种虽想已“衰退妹”了，但积也是不纯馋的，即其执中还有少虫数尚未衰学退的个体雾存在着。复壮的概个念狭义的粱复壮仅腰是一种柄消极的闹措施，渗它指的刻是在菌没种已发罗生衰退器的情况丈下，通面过纯种狼分离和鹊测定生箭产性能糕等方法遵，从衰件退的群血体中找挖出少数患尚未衰购退的个围体，以斤达到恢梁复该菌蕉原有典兴型性状趣的一种林措施；而广义的屯复壮则应递是一项积朴极的措施餐，即在菌筐种的生产律性能尚未稠衰退前就帆经常有意贵识地进行史纯种分离久和生产性控能的测定岭工作，以聋期菌种的桑生产性能错逐步有所奔提高。所可以，这实世际上是一裙种