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生物工程下游技术第十五章_目标产品的蛋白质分析检测与质量控制第1页/共13页一、蛋白质含量和纯度含量:mg/ml,mg/g材料纯度:每单位重量样品中目标蛋白质占总蛋白的比例.是一个相对指标,可用百分比表示.一般指是否含有杂蛋白,而不包括是否含有盐、离子等小分子的物质。纯度等级可分为95%，99%和99.9%等。第2页/共13页蛋白质含量和纯度测定方法含量测定:凯氏定氮法、TCA比浊法、双缩脲法、福林-酚法、紫外线法和考马斯亮兰法（Bradford法）。纯度衡量:电泳法、层析法、质谱法等。一般应采用二种以上方法鉴定纯度，而且同一原理的方法不应该采用二次。第3页/共13页五种蛋白质测定方法比较方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法灵敏度低，适用于0.2~1.0mg氮，误差为

2％费时

8～10小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长双缩脲法灵敏度低1～20mg中速

20~30分钟多肽键＋碱性Cu2＋紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏50～100g快速

5～10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正Folin－酚试剂法灵敏度高～5g慢速

40～60分钟双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法灵敏度最高1～5g快速5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其max由465nm变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS最好的方法；干扰物质少；颜色稳定；

颜色深浅随不同蛋白质变化第4页/共13页氨基酸分析柱后反应法：将游离氨基酸经过色谱柱分离后，氨基酸再与显示剂（茚三酮、荧光胺、邻苯二甲醛）作用。柱前衍生法：将各种氨基酸和荧光试剂先生成氨基酸衍生物，然后再用柱把各种衍生物分开。第5页/共13页蛋白质的分子量测定超离心法光散射方法凝胶过滤法（测完整蛋白质分子）SDS电泳法（测亚基）

较新的方法：毛细管电泳、质谱第6页/共13页等电聚焦法测定蛋白质的等电点鉴定蛋白质的纯度第7页/共13页肽谱指蛋白质被酶解或化学降解后肽段的分离分析或制备。第8页/共13页蛋白质突变点分析天然蛋白质和突变蛋白质肽谱的比较荧光标记Cys;同位素标记法；紫外吸收法第9页/共13页二硫键分析同位素标记化学修饰直接分析二硫键的异构物质谱定位二硫键第10页/共13页蛋白质的序列测定测定蛋白质的一级结构方法：蛋白质化学法：（Edman降解法测定N端和羧肽酶或化学法测定C端）cDNA演译法质谱法二维核磁共振第11页/共13页试分析影

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