第三章基因工程载体演示文稿

第三章基因工程载体演示文稿目前一页\总数三十五页\编于六点优选第三章基因工程载体目前二页\总数三十五页\编于六点

（1）在宿主细胞内能独立复制，ori。（3）多克隆位点：外源基因插入的单一限制酶位点。2.基因工程对载体的要求（7）具有较好的安全性，不能任意转移。（2）有选择性标记

Ampr、Tetr、Kanr等。（4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。（5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。（6）具有对受体细胞的可转移性。目前三页\总数三十五页\编于六点载体的种类

基因工程中常用的载体有5类：

质粒（plasmid）

单链DNA噬菌体M13

噬菌体的衍生物柯斯质粒（cosmid）

动物病毒（virus）

目前四页\总数三十五页\编于六点第一节

质粒载体

一、质粒（plasmid）独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子（CovalentlyClosedCircularDNA,ccc

DNA）。并不是细胞生长所必需的，但可以赋予细胞某些抵御外界环境因素不利影响的能力，如抗生素抗性、对重金属离子的抗性、分泌细菌毒素等。分子量在1-500kb之间广泛存在于细菌。目前五页\总数三十五页\编于六点目前六页\总数三十五页\编于六点5.根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件三、质粒载体的构建1、质粒构建基本策略1.加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于选择转化体2.增加或减少合适的酶切位点，便于重组3.缩短长度，提高导入效率，增加装载量4.改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝目前七页\总数三十五页\编于六点目前八页\总数三十五页\编于六点1.pBR322：p:质粒；BR：质粒两位主要构建者姓氏的第一个字母；322：实验编号人工构建载体三个亲本质粒：pMB1:出发质粒(ColE1)pSF2124:AmprpSC101:TetrpSF2124pMB1pSC101四、经典的大肠杆菌质粒载体目前九页\总数三十五页\编于六点氨苄青霉素和四环素抗性24个单一克隆位点。9个导致Tetr基因失活3个会导致Ampr基因失活目前十页\总数三十五页\编于六点氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copies③

安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。②高拷贝数

①

分子小，克隆能力大长度4363bp，易于纯化，可以携带6-8Kb的外源DNA片段。④具有较多的单一酶切位点（24种）目前十一页\总数三十五页\编于六点4、pUC质粒载体1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322基础上构建的结构：（1）来自于pBR322的Ori（2）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。

但核苷酸序列发生了变化（3）LacZ′基因

编码β—半乳糖酶的α—肽链（4）MCS区段

（MCS）区段位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点。但它并不破坏该基因的功能。目前十二页\总数三十五页\编于六点与pBR322相比，pUC质粒载体优点：（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数

如pUC8为2750bp，pUCl8为2686bp，控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达500～700个拷贝（2）适用于组织化学法检测重组体

通过-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。

（3）具有多克隆位点区段（MCS）

适合不同粘性末端的DNA片段插入，不必连接接头

目前十三页\总数三十五页\编于六点

释放出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，非常容易辨别，如果LacZ’插入外源基因被破坏，菌落则是白色的

。组织化学法检测重组体X-Gal-半乳糖苷酶IPTG诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷

半乳糖

5-溴-4-氯-靛蓝＋目前十四页\总数三十五页\编于六点目前十五页\总数三十五页\编于六点第二节噬菌体载体组成：蛋白质、核酸.结构：蛋白质外壳、尾巴尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。是比细菌还小得多的微生物，噬菌体侵犯细菌，可以认为它是细菌里的“寄生虫”。Bacteriophage(phage)目前十六页\总数三十五页\编于六点一、大肠杆菌的λ-噬菌体DNA（1）线状双链DNA，两端各有一个12bp的互补单链（粘性末端，cohesive-endsite），称λcossite，粘性末端粘连接变成环状DNA。（一）λ-噬菌体的生物学特性1、由外壳包装蛋白和λ-DNA组成λcos位点是噬菌体包装必需序列。

2、λ-DNA的物理图谱48.5kb目前十七页\总数三十五页\编于六点（2）功能相近的基因在基因组中聚集在一起

目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需基因目前十八页\总数三十五页\编于六点（二）λ噬菌体载体的构建1.选用λ噬菌体作为构建克隆载体材料的依据是一种温和噬菌体。能承载比较大的外源DNA片段λDNA分子上有多种限制酶的识别位点2.构建λ噬菌体克隆载体的技术路线用限制酶切去λDNA上的非必需区在λDNA上非必需区内插入选择标记基因建立λDNA分子体外包装系统目前十九页\总数三十五页\编于六点目前二十页\总数三十五页\编于六点

（1）插入式载体只具有一个可供外源DNA插入的限制酶位点的λ噬菌体。常用：λgt10、λNM1149等载体.（2）置换型载体（取代型载体）具有成对的限制酶位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。

常用：EMBL3、EMBL4二.λ噬菌体载体的主要类型目前二十一页\总数三十五页\编于六点三、λ-DNA作为载体的优点可在体外包装成噬菌体颗粒，高效转染大肠杆菌λ-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量重组。λ-DNA分子的筛选较为方便。

λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，常用于构建基因文库缺点：(1)需要包装比较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋白的费用又高；(2)没有质粒的用途广泛。目前二十二页\总数三十五页\编于六点第三节、人工染色体克隆载体

基本元件：含有质粒克隆载体所必需的第一受体（大肠杆菌）的质粒复制起始点；第二受体（如酵母菌）染色体DNA着丝点、端粒和复制起始点的序列.合适的选择标记基因。

利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。酵母人工染色体（YAC）细菌人工染色体（BAC）目前二十三页\总数三十五页\编于六点（一）酵母人工染色体（YAC）

把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母chr的转录功能和复制功能。

装载量为350-400kb含有的元件：酵母自主复制序列(ARS)着丝粒序列(cen)四膜虫端粒（tel）质粒选择标记酵母系统的选择标记质粒复制起点目前二十四页\总数三十五页\编于六点一、YAC的基本序列元件酵母染色体DNA自主复制序列（ARS）酵母染色体的着丝粒序列（CEN）酵母染色体的端粒序列（TEL）酵母人工染色体（YAC）YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。

目前二十五页\总数三十五页\编于六点酵母自主复制序列（ARS)

一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必需的信号。

目前二十六页\总数三十五页\编于六点酵母着丝点(CEN)在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。pYAC4：酵母第四条染色体的着丝粒。目前二十七页\总数三十五页\编于六点正常酵母人工染色体含有：*四膜虫端粒（tel）定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解，形成稳定的结构。目前二十八页\总数三十五页\编于六点二、

YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因TRP1：色氨酸生物合成基因缺陷型

URA3：尿嘧啶生物合成基因缺陷型

LEU2：亮氨酸合成基因缺陷型

SUP

4：赭石突变抑制基因

目前二十九页\总数三十五页\编于六点克隆位点：位于sup4基因内SuP4是一个赭石突变（UAA）抑制基因。宿主酵母菌的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2。在赭石突变宿主中，没有外源基因插入时，sup4基因抑制赭石突变，则形成正常白色菌落；有外源基因插入时，sup4基因遭破坏，则形成红色菌落，十分容易挑选出有DNA插入片段的红色菌落，建成YAC文库。目前三十页\总数三十五页\编于六点YAC克隆DNA片段的过程是：目的基因在限制性内切酶酶解后变成大片段DNA，克隆进酵母载体DNA，转染酵母缩主细胞，扩增后，根据标记性状筛选出重组的人工染色体。三、克隆策略目前三十一页\总数三十五页\编于六点酵母人工染色体的使用目前三十二页\总数三十五页\编于六点四、酵母人工染色体（YAC）缺点首先，在YAC载体的插入片段会出现缺失和基因重排的现象。其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个YAC中的插入片段由2个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的5%～50%。第三，YAC染色体与宿主细胞的染色体大小相近，就很难从中分离出来，影响了YAC载体的广泛应用。

目前三十三页\总数三十五页\编于六点（二）细菌人工染色体（BAC）

1992年Shizuya利用F因子的复制起点和氯霉素抗性标记基因，在F质粒（pMBO131）基础上构建了第一代BAC人工染色体。能够克隆和保持大于