低氧预处理诱导骨髓间充质干细胞Pim-1激酶高表达抑制细胞凋亡

www.CRTERwww.CRTER.org张优，等.低氧预处理诱导骨髓间充质干细胞Pim-1激酶高表达抑制细胞凋亡www.CRTERwww.CRTER.org张优，等.低氧预处理诱导骨髓间充质干细胞Pim-1激酶高表达抑制细胞凋亡PAGE2000P.O.Box10002PAGE3P.O.Box1200,PAGE1989ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH低氧预处理诱导骨髓间充质干细胞Pim-1激酶高表达抑制细胞凋亡文章快速阅读：低氧预处理诱导骨髓间充质干细胞Pim-1激酶高表达抑制细胞凋亡低氧预处理诱导骨髓间充质干细胞Pim-1激酶高表达抑制细胞凋亡 文题释义：低氧预处理：低氧预处理能激活细胞内的一些保护机制，增强干细胞的抗凋亡和旁分泌功能，促进干细胞的存活和新生血管形成，从而进一步促进组织修复和功能恢复，提高干细胞移植效果，且无致肿瘤形成风险。Pim-1：摘要背景：骨髓间充质干细胞移植入缺血心肌后存活率低，而低氧有可能增强骨髓间充质干细胞的增殖，促进其存活。目的：探讨Pim-1激酶是否介导缺氧预处理对骨髓间充质干细胞的保护作用及其机制。方法：设置不同低氧处理时间(0，6，12，24h)处理骨髓间充质干细胞，RT-qPCR及Westernblot检测Pim-1及凋亡相关基因的表达，确定最佳低氧处理时间为12h。将骨髓间充质干细胞分为3组：正常对照组、低氧组、低氧+Pim-1抑制剂组，分别进行Transwell迁移实验、细胞凋亡流式检测、线粒体膜电位检测评估各组骨髓间充质干细胞的迁移能力及抗凋亡能力；建立心肌梗死模型，1周后按分组在大鼠梗死心肌周围多点注射骨髓间充质干细胞，2周后制备心肌冰冻切片行DiI染色统计骨髓间充质干细胞存活数量；心肌梗死模型建立前后、细胞移植4周行超声心动图检查评估大鼠心脏功能。结果与结论：关键词：主题词：骨髓；间质干细胞；细胞低氧；细胞凋亡；心肌梗塞；组织工程PAGE1997ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4P.O.Box1200,Shenyang110004kf23385083@HypoxicpreconditioninginhibitsapoptosisofbonemarrowmesenchymalstemcellsthroughoverexpressingPim-1ZhangYou1,YanWei-ya2,ShenZheng-ya2,YangJun-jie3,HuiJie1(1DepartmentofCardiology,2DepartmentofCardiovascularSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215000,JiangsuProvince,China;3InstituteofCardiovascularDisease,SoochowUniversity,Suzhou215000,JiangsuProvince,China)AbstractBACKGROUND:Bonemarrowmesenchymalstemcellshavealowsurvivalrateafterimplantedintotheischemicmyocardium.However,hypoxiapreconditioning(HPC)mayenhancebonemarrowmesenchymalstemcellproliferationandpromoteitssurvivalrate.OBJECTIVE:ToexplorewhetherPim-1isinvolvedinHPCprotectingagainstapoptosisofbonemarrowmesenchymalstemcellsandtherelevantmechanism.METHODS:BonemarrowmesenchymalstemcellswererespectivelysubjectedtoHPCfor0,6,12,and24hours.TheexpressionofPim-1andapoptosis-relatedgenesweredetectedbyRT-qPCRandwesternblot.Then,thebesthypoxicpreconditioningtimewasdeterminedas12hours.Then,bonemarrowmesenchymalstemcellswereassignedtooneofthefollowinggroups:control(withoutHPC),12-hourHPC,12-hourHPC+Pim-1inhibitorgroups.Flowcytometryanalysiswasusedtodetectthecellapoptosis,Transwellassaytoanalyzethecellmigrationabilityineachgroup,andJC-1kittodetectmitochondrialmembranepotential.Animalmodelsofmyocardialinfarctionwereestablished.Oneweekaftermodeling,bonemarrowmesenchymalstemcellsweregivenviamulti-pointinjectionaroundtheinfarctzoneofrats.Twoweeksaftermodeling,hearttissuesofratsweretakenandslicedfollowedbyDiIstainingtocalculatethesurvivalrateofbonemarrowmesenchymalstemcells.Additionally,ratcardiacfunctionwasassessedbyechocardiographypriortoandaftermodelingaswellasat4weeksaftercelltransplantation.RESULTSANDCONCLUSION:At12hoursafterHPC,theexpressionofPim-1,p-AktandBcl-2geneintheinfarctregionwassignificantlyincreased,buttheexpressionofcaspase-3andBaxwassignificantlydecreased.Comparedwiththecontrolgroup,cellviabilityinthe12-hourHPCgroupwasincreasedverysignificantlyat1weekaftercelltransplantation(P<0.001),themigrationandanti-apoptosisabilitywereenhancedsignificantly(P<0.01)andthecardiacfunctionofratswassignificantlyimprovedinthe12-hourHPCgroup(P<0.05).AlloftheseprotectiveeffectswereblockedbythePim-1inhibitor.ThesefindingsindicatethatHPCcanprotectbonemarrowmesenchymalstemcellsfromapoptosisthroughactivatingAktandup-regulatingPim-1,andtherebyimprovethetherapeuticeffectofbonemarrowmesenchymalstemcelltransplantationonischemicheartdiseases.Subjectheadings:BoneMarrow;MesenchymalStemCells;CellHypoxia;Apoptosis;MyocardialInfarction;TissueEngineeringCitethisarticle:ZhangY,YanWY,ShenZY,YangJJ,HuiJ.HypoxicpreconditioninginhibitsapoptosisofbonemarrowmesenchymalstemcellsthroughoverexpressingPim-1.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(14):1989-1998.ZhangYou,Studyingformaster’sdegree,DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,ZhangYou,Studyingformaster’sdegree,DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215000,JiangsuProvinceYanWei-ya,Master,DepartmentofCardiovascularSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215000,JiangsuProvince,ChinaZhaogYouandYanWei-yacontributedtoequallythiswork.Correspondingauthor:HuiJie,Professor,Doctoralsupervisor,DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215000,JiangsuProvinceCorrespondingauthor:YangJun-jie,M.D.,Associateprofessor,InstituteofCardiovascularDisease,SoochowUniversity,Suzhou215000,JiangsuProvince0引言Introduction1材料和方法Materialsandmethods1.1设计分子水平、细胞水平体外观察及随机对照动物实验。1.2时间及地点实验于2014年10月至2015年10月在苏州大学附属第一医院心血管病研究所完成。1.3材料1.3.1实验动物4周龄SD大鼠数只，雌雄不限，体质量80g左右，用于提取骨髓间充质干细胞；雌性SD大鼠30只，6-8周龄，体质量300-3501.3.2主要试剂及仪器DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)，2-巯基乙醇(美国Amresco公司)，Quercetagetin(美国Callbiochem公司)，DAPI染色液、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、β-actin/GAPDH羊抗鼠多克隆抗体、辣根酶标记山羊抗鼠IgG抗体(中国碧云天生物技术研究所)，DiI染色液、PureLinkTMRNAMiniKit(美国Invitrign公司)，Anti-ratPim-1抗体(美国SantaCruz公司)，Anti-ratt-Akt抗体、Anti-ratp-Akt抗体(美国Signaling公司)，垂直流洁净工作台YJ-1450B(苏州宏伟净化设备有限公司)，倒置荧光显微镜、倒置光学显微镜(日本Olympus公司)，流式细胞仪FACSCaliber(美国BD公司)，371.4实验方法1.4.1大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、体外扩增及鉴定SD大鼠颈椎脱臼法处死，体积分数为75%乙醇全身浸泡10min。无菌条件下取出双侧股骨、胫骨，置于一个预先加入DMEM培养基的培养皿中，去除两端骨骺，以无血清培养基反复冲洗骨髓腔至骨髓腔发白，收集骨髓悬液，4℃离心(1500r/min×5min)，弃上清液，加入培养基(L-DMEM、体积分数为10%胎牛血清、5%青/链霉素)吹打成悬液，接种于培养皿中，24h后首次半量换液，以后每隔3d换液1次，并按1∶2比例传代。经多次传代扩增培养，使骨髓间充质干细胞逐渐得到纯化和扩增。应用流式细胞仪检测大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原表达进行鉴定[20]。以下实验用第31.4.2RT-PCR检测Pim-1及凋亡相关基因表达设置不同低氧处理时间(0，6，12，24h)处理骨髓间充质干细胞，即用低氧培养箱模拟低氧环境(体积分数为1%氧气、体积分数为5%二氧化碳、体积分数为94%氮气)，在0，12，18h时分别将骨髓间充质干细胞放入低氧培养箱，24h后取出，其分别表示低氧处理24，12，6h，低氧0h表示未低氧处理细胞。RNA的抽提由RNA抽提试剂盒(PureLinkTMRNAMiniKit)完成，以18S为内参照，按说明书建立20μL反应体系进行反转录，然后进行荧光定量PCR扩增，反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火20s，共进行40个循环。扩增结束后，以目的基因β-actin、Pim-1、bcl-2、caspase-3、bax表达的相对定量值进行统计学分析。用primer5.0软件设计引物序列如下：β-actin上游：5’-CCACCATGTACCCAGGCATT-3’，下游：5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’；Pim-1上游：5’-CCGTGGATGCAGGATGTTCT-3’，下游：5’-AGCTCTCTCTTCCCTGGAGG-3’；Caspase-3上游：5’-CACACGGGACTTGGAAAGCA-3’，下游：5’-GAGAGCCAGCGATGACTCAG-3’；bax上游：5’-CATCATGGGCTGGACACTGG-1.4.3Westernblot检测Pim-1及Akt蛋白表达设置不同时间段(0，6，12，24h)低氧处理骨髓间充质干细胞，并在6，12，24h设置Pim-1抑制剂处理组，分别收集各组细胞，裂解液提取蛋白，进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转染至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1h后，加入羊抗鼠Pim-1/t-Akt/p-Akt抗体(1∶100-1∶1000)结合，洗膜后加入羊抗鼠IgG(1∶1000)结合，再次洗膜后加入Westernblot显影液曝光，分析灰度值。1.4.4实验分组根据RT-PCR检测结果，确定最佳低氧处理时间为12h，然后将骨髓间充质干细胞分为正常对照组、低氧12h组及低氧12h+Pim-1抑制剂组。低氧12h+Pim-1抑制剂组在低氧处理前，给予细胞换液，向细胞培养基中加入一定量Pim-1抑制剂六羟黄酮(Quercetagetin)，使其维持在工作浓度(10μmol/L)，随后进行低氧处理。1.4.5T用；将Transwel1.4.6AnnexinV-FITC流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞的凋亡准备1×AnnexinV稀释液，准备100mg/L的PI工作液，消化离心3组骨髓间充质干细胞，AnnexinV稀释液重悬细胞，计数调整细胞浓度至1×109L-1，1.4.7细胞线粒体膜电位检测(JC-1)将骨髓间充质使细胞线粒体膜电位全丧失(呈绿色荧光)；取50μLJC-1(200×)加入8mL超纯水中，剧烈振荡混匀后加入2mLJC-1染色缓冲液(5×)混匀即为JC-1染色工作液；去除24孔板中细胞培养基，PBS洗1次，加入250μL细胞培养液，加入250μLJC-1染色工作液，混匀后培养箱中孵育20min；蒸馏水稀释JC-染色缓冲液至1×，孵育结束后，去除培养基，用1×JC-1缓冲液清洗细胞2次，置于冰上，荧光显微镜下观察。1.4.8大鼠心肌梗死模型建立取体质量300-350gSD雄性大鼠，10%水合氯醛按3mL/kg腹腔麻醉，呼吸机正压辅助呼吸；于大鼠左侧第4肋间横切口开胸，暴露心脏，剪开心包，在肺动脉圆锥与左心耳交界稍下1.0-2.0mm1.4.9DiI染色液细胞标记用Hank’s按1∶1000稀释CM-DiI原液(1g/L)，分别将正常对照组、低氧12h组、低氧12h+Pim-1抑制剂组细胞消化计数重悬至浓度为1×108L-1，将CM-DiI稀释液和细胞悬液按照1∶8混匀，培养箱培养5min，然后4℃1.4.10心肌内细胞注射1周后再次开胸，直视下于梗死心肌周围用微量注射器分4点(各个点相距90°)分别注射各组骨髓间充质干细胞，关胸，维持辅助呼吸至自主呼吸恢复，送回笼中精心饲养。1.4.11大鼠超声心动图检查心肌梗死模型建立前后、细胞移植后4周(每组剩余5只)分别用水合氯醛腹腔注射麻醉、左侧胸部备皮，用15MHz探头行超声心动图检查，主要测量左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVEDs)及左室射血分数(LVEF)，测量至少重复3个心动周期，取平均值。1.4.12心肌冰冻切片制备及染色心肌内细胞注射1周后，每组随机抽取3只，麻醉后开胸取心脏，肝素水冲洗心脏后置于体积分数为4%甲醛溶液中固定24h，修剪心脏，保留结扎线至心尖部心肌组织，10%蔗糖溶液中浸泡24h，取出心脏，O.C.T.Compound包埋剂包埋心肌组织，-201.5主要观察指标①不同低氧时间处理后骨髓间充质干细胞中Pim-1、凋亡相关基因及Akt表达变化。②Transwell迁移实验、AnnexinV-FITC凋亡实验、JC-1实验分别观察各组细胞迁移功能、凋亡率及细胞线粒体膜电位变化。③心肌组织切片染色观察各组细胞移植后的存活情况。④心脏超声观察心肌梗死及细胞移植后大鼠心功能变化。1.6统计学分析由第一作者应用SPSS19.0统计软件进行分析，实验数据以±s表示，组间比较，方差齐采用OneWayANOVA，方差不齐采用多组独立样本的秩和检验，两两组间比较采用LeastSignificantDifferenceTest及Bonfferoni法，P<0.05为差异有显著性意义。2结果Results2.1骨髓间充质干细胞培养、扩增和鉴定原代培养24h后有少量细胞贴壁，呈短梭形，椭圆形，三角形等。5-7d后可见集落形成，呈漩涡状。传代后细胞形态趋于一致，以长梭形多见。流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞表面标记，CD34、CD45表达阴性，CD29、CD90表达阳性。2.2RT-PCR检测Pim-1及凋亡相关基因在低氧条件下的表达随着低氧处理时间的延长，Pim-1表达量在低氧处理12h最高，Bax表达量最低，与其他组比较差异均有显著性意义(图1)；低氧处理12h时，骨髓间充质干细胞的Bcl-2表达量明显升高，Caspase-3明显降低(图2)，与低氧处理24h组比较差异无显著性意义(P>0.05)，与低氧处理0h组及低氧处理6h组比较差异均有显著性意义。表1表1不同时期各组大鼠心功能比较(±s，n=8)Table1Comparisonofratcardiacfunctionamongdifferentgroupsindifferentperiods组别左室射血组别左室射血分数(%)左室舒张末期内径(mm)左室收缩末期内径(mm)造模前正常对照组低氧12h组低氧12h+Pim-1抑制剂组82.04±2.5625.96±0.6793.65±0.35881.18±3.8546.13±0.4633.55±0.70583.33±3.3815.89±0.7823.42±0.479造模后正常对照组低氧12h组低氧12h+Pim-1抑制剂组54.08±3.4674.75±0.2591.63±0.77556.89±4.8105.36±0.2641.98±0.25957.45±4.6705.19±0.3251.77±0.671细胞移植后4周正常对照组低氧12h组低氧12h+Pim-1抑制剂组59.68±5.7394.70±0.4521.65±0.48570.46±8.8565.22±0.6471.95±0.69362.14±7.5385.18±0.5281.85±0.93表注：表注：与其他组比较，aP<0.05。2.3Westernblot检测Pim-1及其上游Akt激酶在低氧条件下的表达Westernblot结果见图3，统计分析灰度值后，可见Pim-1及p-Akt在不同低氧时间下变化趋势一致，均在低氧处理12h时表达量最高，与其他组之间差异有显著性意义(图4)；低氧不影响骨髓间充质干细胞t-Akt的表达(P>0.05)。2.4不同条件下骨髓间充质干细胞迁移功能的变化低氧处理12h组骨髓间充质干细胞迁移细胞数量明显多于正常对照组(P<0.01)，且增强的迁移功能可部分被Pim-1抑制剂所抑制(P<0.05)，见图5，6。2.5不同条件下骨髓间充质干细胞的凋亡率低氧12h组骨髓间充质干细胞的凋亡率明显少于正常对照组和低氧12h+Pim-1抑制剂组，差异有显著性意义(P<0.05)，而低氧12h+Pim-1抑制剂组和正常对照组之间细胞凋亡率差异无显著性意义(P>0.05)，见图7，8。2.6不同条件下线粒体膜电位变化情况由图9，10可见，阳性对照组细胞全部呈绿色荧光，低氧12h组骨髓间充质干细胞红色荧光较正常对照组及低氧12h+Pim-1抑制剂组明显增多，差异有显著性意义(P<0.05)；低氧12h+Pim-1抑制剂组与正常对照组骨髓间充质干细胞存活数量差异无显著性意义(P>0.05)。2.7各组骨髓间充质干细胞移植后成活率骨髓间充质干细胞移植至梗死心肌周围1周后，制作心肌冰冻切片、染色(每组取6张切片，每张取1个视野)，计算骨髓间充质干细胞的成活数；统计分析结果如图11，12所示，低氧12h组存活细胞明显多于正常对照组及低氧12h+Pim-1抑制剂组，差异有显著性意义(P<0.001)，而低氧12h+Pim-1抑制剂组与正常对照组细胞存活数量差异无显著性意义(P>0.05)。2.8心肌梗死模型建立及骨髓间充质干细胞移植前后超声心动图改变如表1所示，造模前及造模后各组射血分数值差异无显著性意义(P>0.05)；而干细胞移植后4周低氧12h组大鼠射血分数值明显增加，与其他两组之间差异有显著性意义(P<0.05)；各组之间左室舒张末期内径、左室收缩末期内径差异无显著性意义(P>0.05)。3讨论Discussion近年来，骨髓间充质干细胞移植作为急性心肌梗死的新疗法为其带来了一片曙光，然而移植后骨髓间充质干细胞的存活率低成为人们面临的困难和挑战；Qu等[22]研究发现，心肌梗死后局部恶劣的微环境，包括缺血、缺氧以及强烈的炎症反应，导致移植干细胞大量凋亡。骨髓间充质干细胞移植前预处理是目前提高其移植后成活率和改善治疗效果的主要方式。近年来，有研究证明，适当的低氧(0.1%-3%)可通过诱导HIF-1α表达抑制骨髓间充质干细胞的自噬作用而增强细胞的存活能力，改善其治疗作用[23]；实验结果发现，低氧预处理可通过激活Akt/Pim-1信号通路抑制骨髓间充质干细胞凋亡，提高移植后存活率，并能进一步提高骨髓间充质干细胞对急性心肌梗死的治疗效果。Pim-1和Akt均为细胞程序性死亡的相关蛋白激酶，Pim-1作为Akt信号通路下游基因已被证实可通过各种途径保护心脏[16，24，16]；Akt是一种影响多种细胞新陈代谢、细胞周期、细胞生长和凋亡的信号激酶[25-26]，其可通过上调Pim-1表达发挥心脏保护作用，抑制急性心肌梗死后心肌细胞凋亡、心脏重塑，保护心脏结构，改善心脏功能[16-17，27-28]。在骨髓间充质干细胞中，Pim-1已被证实可联合血清信号通路促进骨髓间充质干细胞的增殖[29]；实验首次发现，低氧预处理可促进骨髓间充质干细胞中Pim-1和p-Akt的表达，并且两者的表达均呈时间依赖性、且趋势相同；进一步研究发现，低氧可调节Bcl-2家族表达，促进抗凋亡因子Bcl-2表达，抑制促凋亡因子Bax的表达；此外，低氧还可降低细胞质中凋亡蛋白酶Caspase-3的水平，减轻线粒体损伤，抑制细胞凋亡。图1不同低氧时间骨髓间充质干细胞中Pim-1和Bax基因的表达Figure1ThemRNAexpressionofPim-1andBaxinbonemarrowmesenchymalstemcellswithhypoxicpreconditioningfordifferenttime低氧0h低氧6h低氧12h低氧24h图1不同低氧时间骨髓间充质干细胞中Pim-1和Bax基因的表达Figure1ThemRNAexpressionofPim-1andBaxinbonemarrowmesenchymalstemcellswithhypoxicpreconditioningfordifferenttime低氧0h低氧6h低氧12h低氧24hCaspase-3相对表达2.52.01.51.00.50低氧0h低氧6h低氧12h低氧24hBcl-2相对表达543210P<0.01P<0.05P<0.05低氧0h低氧6h低氧12h低氧24hBax相对表达8642020151050Pim-1相对表达P<0.01P<0.05P<0.05P<0.01P<0.05P>0.05P<0.01P<0.01P>0.05低氧低氧0h低氧6h低氧12h低氧24h图图2不同低氧时间骨髓间充质干细胞中Bcl-2和Caspase-3基因的表达Figure2ThemRNAexpressionofBcl-2andCaspase-3inbonemarrowmesenchymalstemcellswithhypoxicpreconditioningfordifferenttime低氧12h+Pim-1抑制剂组低氧12h组正常对照组100806040200P<0.05P<0.01P>0.05低氧12h+Pim-1抑制剂组低氧12h组正常对照组100806040200P<0.05P<0.01P>0.05β-actint-AktPim-1p-Akt1234567图3不同条件下骨髓间充质干细胞中相关蛋白表达Figure3Theexpressionofrelatedproteinsinbonemarrowmesenchymalstemcellswithdifferenttreatments图注：1：低氧0h组；2：低氧6h+Pim-1抑制剂组；3：低氧6h组；4：低氧12h+Pim-1抑制剂组；5：低氧12h组；6：低氧24h+Pim-1抑制剂组；7：低氧24h组。Pim-1抑制剂处理无Pim-1抑制剂处理Pim-1抑制剂处理无Pim-1抑制剂处理240220200180160140120p-Akt表达ccbbba2502001500Pim-1表达cbbba061224低氧处理时间(h)061224图4不同条件下骨髓间充质干细胞中Pim-1和p-Akt的表达Figure4TheexpressionofPim-1andp-Aktinbonemarrowmesenchymalstemcellswithdifferenttreatments图注：与低氧处理12h比较，aP<0.001，bP<0.01，cP<0.05。β-actint-AktPim-1p-Akt1234567图3不同条件下骨髓间充质干细胞中相关蛋白表达Figure3Theexpressionofrelatedproteinsinbonemarrowmesenchymalstemcellswithdifferenttreatments图注：1：低氧0h组；2：低氧6h+Pim-1抑制剂组；3：低氧6h组；4：低氧12h+Pim-1抑制剂组；5：低氧12h组；6：低氧24h+Pim-1抑制剂组；7：低氧24h组。Pim-1抑制剂处理无Pim-1抑制剂处理Pim-1抑制剂处理无Pim-1抑制剂处理240220200180160140120p-Akt表达ccbbba2502001500Pim-1表达cbbba061224低氧处理时间(h)061224图4不同条件下骨髓间充质干细胞中Pim-1和p-Akt的表达Figure4TheexpressionofPim-1andp-Aktinbonemarrowmesenchymalstemcellswithdifferenttreatments图注：与低氧处理12h比较，aP<0.001，bP<0.01，cP<0.05。迁移细胞数迁移细胞数图图6不同条件下骨髓间充质干细胞迁移能力比较Figure6Comparisonofthemigrationabilitiesofbonemarrowmesenchymalstemcellswithdifferenttreatments低氧处理时间低氧处理时间(h)节Bcl-2家族基因增强细胞生存能力[34-35]；Pim-1既促进正常对照组正常对照组低氧12h组低氧12h+Pim-1抑制剂组图5不同条件下骨髓间充质干细胞的迁移情况(×200)图5不同条件下骨髓间充质干细胞的迁移情况(×200)Figure5Themigrationofbonemarrowmesenchymalstemcellswithdifferenttreatments(×200)图注：低氧处理12h组骨髓间充质干细胞迁移细胞数量明显多于正常对照组，且增强的迁移功能可部分被Pim-1抑制剂所抑制。图7图7不同条件下骨髓间充质干细胞的凋亡情况Figure7Theapoptosisofbonemarrowmesenchymalstemcellswithdifferenttreatments正常对照组正常对照组低氧12h组低氧12h+Pim-1抑制剂组151050P<0.01P<0.05151050P<0.01P<0.05低氧12h+Pim-1抑制剂组低氧12h组正常对照组P>0.05403020100线粒体膜电位P<0.05P<0.05线粒体膜电位P<0.05P<0.05凋亡率(%)凋亡率(%)低氧12h组正常对照组低氧12h组+低氧12h组正常对照组低氧12h组+Pim-1抑制剂组图10图10不同条件下骨髓间充质干细胞的线粒体膜电位变化Figure10Thechangesofmitochondrialmembranepotentialinbonemarrowmesenchymalstemcellswithdifferenttreatments图8不同条件下骨髓间充质干细胞的凋亡率Figure8Theapoptoticrateofbonemarrowmesenchymalstemcellswithdifferenttreatment图9不同条件下骨髓间充质干细胞的线粒体膜电位变化(×200)Figure9Thechangesofmitochondrialmembranepotentialinbonemarrowmesenchymalstemcellswithdifferenttreatments(×200)图注：绿色荧光表示线粒体去极化、膜电位降低、细胞发生早期凋亡，红色荧光表示线粒体膜电位较高、线粒体基本正常。图9不同条件下骨髓间充质干细胞的线粒体膜电位变化(×200)Figure9Thechangesofmitochondrialmembranepotentialinbonemarrowmesenchymalstemcellswithdifferenttreatments(×200)图注：绿色荧光表示线粒体去极化、膜电位降低、细胞发生早期凋亡，红色荧光表示线粒体膜电位较高、线粒体基本正常。阳性对照组阳性对照组正常对照组低氧12h组低氧12h+Pim-1抑制剂组正常对照组低氧12h组低氧12正常对照组低氧12h组低氧12h+Pim-1抑制剂组图11各组骨髓间充质干细胞移植1周后成活情况(×200)图11各组骨髓间充质干细胞移植1周后成活情况(×200)Figure11Thesurvivalofbonemarrowmesenchymalstemcellat1weekaftercelltransplantation(×200)PAGE2001ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4P.O.Box1200,Shenyang110004kf23385083@P<0.001P>0.05图12各组骨髓间充质干细胞移植1周后成活细胞数Figure12Thesurvivalrateofbonemarrowmesenchymalstemcellsat1weekaftercelltransplantationP<0.001P<0.001P>0.05图12各组骨髓间充质干细胞移植1周后成活细胞数Figure12Thesurvivalrateofbonemarrowmesenchymalstemcellsat1weekaftercelltransplantationP<0.001低氧12h+Pim-1抑制剂组低氧12h组正常对照组成活细胞数200150100500抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-XL的表达，又能够抑制促凋亡因子Bax/Bak凋亡的表达和释放，从而保护线粒体完整性，抑制细胞凋亡[36]；此外，实验研究发现，在细胞质中，Bcl-2可直接干预Bak，抑制其释放到线粒体中[37]；实验结果发现，低氧预处理后，骨髓间充质干细胞中Pim-1表达呈时间依赖性，其趋势与Bcl-2相同而与Bax相反，与既往研究结果一致。Akt亦可通过保护心肌细胞线粒体完整性、抑制细胞凋亡，发挥保护心脏作用[38-39]；除了调节Bcl-2家族基因之外，Akt还可通过抑制GSK-3β或促进已糖激酶的表达等途径保护线粒体完整性，发挥心脏的保护作用[21]。然而，低氧及Pim-1抑制剂共同处理后的骨髓间充质干细胞抗凋亡能力与正常对照组无差异(P>0.05)，表明Akt是通过诱导Pim-1的表达发挥细胞保护作用，与既往研究一致[14-16，40-41]。Akt/Pim-1可诱导Bcl-2的表达，Bcl-2除了通过抑制Bcl-2家族之外，还可通过调节线粒体膜电位阻止细胞色素C的释放[42]。线粒体膜电位的下降被认为是细胞早期不可逆凋亡事件[43]。线粒体膜电位的下降可以促进细胞色素C的释放，从而促进其下游Caspase的激活，从而刺激凋亡的细胞死亡。实验结果表明低氧12h组骨髓间充质干细胞中Pim-1及Bcl-2表达较对照组明显升高、Caspase表达明显降低，且JC-1检测提示低氧预处理可延缓骨髓间充质干细胞膜电位下降；故推测细胞色素C与Pim-1必存在相关性，有待于进一步研究。此外，还有研究证实，Pim-1可通过阻止线粒体裂解蛋白移位保护线粒体完整性，抑制细胞凋亡[44]。低氧预处理可增强骨髓间充质干细胞的迁移能力[45-50]，其机制被广泛研究；目前已证实低氧可通过KV2.1通道和FAK激酶激活[45]、RhoA信号通路激活[46-47]、诱导HIF-1α[47-48]、改变整合素表达[49]、激活SDF-1/CXCR4通路等途径提高骨髓间充质干细胞的迁移能力[50]；通过迁移实验发现低氧预处理后可增强骨髓间充质干细胞的迁移能力，然而低氧12h+Pim-1抑制剂组骨髓间充质干细胞迁移能力并未明显改变，与对照组之间差异无显著性意义(P>0.05)，这说明Pim-1在低氧增强骨髓间充质干细胞的迁移能力中起着重要作用，其可能通过与上述骨髓间充质干细胞迁移机制之间相互作用共同发挥调节骨髓间充质干细胞的迁移。实验观察了正常对照组、低氧12h组及低氧12h+Pim-1抑制剂组骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死的效果及移植1周后心肌中骨髓间充质干细胞的存活状况，发现低氧预处理组骨髓间充质干细胞移植4周后存活率最高，心功能较其他两组明显改善；而低氧12h+Pim-1抑制剂组骨髓间充质干细胞存活率及大鼠心功能均较对照组无明显差异，进一步证明低氧可上调Pim-1表达进而抑制骨髓间充质干细胞凋亡，改善移植后治疗急性心肌梗死的效果。总之，低氧预处理可激活骨髓间充质干细胞的Akt/Pim-1信号通路，保护线粒体完整性，促进骨髓间充质干细胞迁移，抑制骨髓间充质干细胞凋亡，进一步改善骨髓间充质干细胞移植后大鼠心功能；丰富了对低氧预处理后骨髓间充质干细胞功能改变的理论，对骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死提供指导意义。作者贡献：实验设计、实施、评估均由全部作者完成。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethicalissuesinanimalexperimentation》相关动物伦理学标准的条例。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：本刊实行双盲外审制度，文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。作者声明：文章第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4参考文献ReferencesAvailableat:http:///healthinfo/global_burden_disease/estimates/en/index1.html(accessed16Feb2015).WorldHealthOrganization.GlobalHealthEstimates.2014Summarytables:Deathsbycause,ageandsex,byWHOregion,2000–2012,2014.Availableat:http:///healthinfo/global_burden_disease/estimates/en/index1.html(accessed16Feb2015).Lloyd-JonesD,AdamsRJ,BrownTM,etal.Executivesummary:heartdiseaseandstrokestatistics--2010update:areportfromtheAmericanHeartAssociation.Circulation.2010;121(7):948-954.O'GaraPT,KushnerFG,AscheimDD,etal.2013ACCF/AHAguidelineforthemanagementofST-elevationmyocardialinfarction:areportoftheAmericanCollegeofCardiologyFoundation/AmericanHeartAssociationTaskForceonPracticeGuidelines.Circulation.2013;127(4):e362-425.NairV,MadanH,SofatS,etal.Efficacyofstemcellinimprovementofleftventricularfunctioninacutemyocardialinfarction--MI3Trial.IndianJMedRes.2015;142(2):165-174.SchächingerV,DimmelerS,ZeiherAM.Stemcellsaftermyocardialinfarction.Herz.2006;31(2):127-136.LemarchandP.Celltherapyforacutemyocardialinfarction.TransfusClinBiol.2009;16(2):146-147.SiuCW,LiaoSY,LiuY,etal.Stemcellsformyocardialrepair.ThrombHaemost.2010;104(1):6-12.JoggerstSJ,HatzopoulosAK.Stemcelltherapyforcardiacrepair:benefitsandbarriers.ExpertRevMolMed.2009;11:e20.ShiotaM,HeikeT,HaruyamaM,etal.Isolationandcharacterizationofbonemarrow-derivedmesenchymalprogenitorcellswithmyogenicandneuronalproperties.ExpCellRes.2007;313(5):1008-1023.MiyaharaY,NagayaN,KataokaM,etal.Monolayeredmesenchymalstemcellsrepairscarredmyocardiumaftermyocardialinfarction.NatMed.2006;12(4):459-465.SchächingerV,ErbsS,ElsässerA,etal.Intracoronarybonemarrow-derivedprogenitorcellsinacutemyocardialinfarction.NEnglJMed.2006;355(12):1210-1221.BachmannM,MöröyT.Theserine/threoninekinasePim-1.IntJBiochemCellBiol.2005;37(4):726-730.WangZ,BhattacharyaN,WeaverM,etal.Pim-1:aserine/threoninekinasewitharoleincellsurvival,proliferation,differentiationandtumorigenesis.JVetSci.2001;2(3):167-179.BorilloGA,MasonM,QuijadaP,etal.Pim-1kinaseprotectsmitochondrialintegrityincardiomyocytes.CircRes.2010;106(7):1265-1274.MuraskiJA,RotaM,MisaoY,etal.Pim-1regulatescardiomyocytesurvivaldownstreamofAkt.NatMed.2007;13(12):1467-1475.GaoY,LiT,WuC,etal.Pim-1mediatedsignalingduringtheprocessofcardiacremodelingfollowingmyocardialinfarctioninovinehearts.JMolCellCardiol.2013;63:89-97.ChenJ,KobayashiM,DarmaninS,etal.Hypoxia-mediatedup-regulationofPim-1contributestosolidtumorformation.AmJPathol.2009;175(1):400-411.HuS,YanG,XuH,etal.Hypoxicpreconditioningincreasessurvivalofcardiacprogenitorcellsviathepim-1kinase-mediatedanti-apoptoticeffect.CircJ.2014;78(3):724-731.PolisettiN,ChaitanyaVG,BabuPP,etal.Isolation,characterizationanddifferentiationpotentialofratbonemarrowstromalcells.NeurolIndia.2010;58(2):201-208.PiaoH,YounTJ,KwonJS,etal.Effectsofbonemarrowderivedmesenchymalstemcellstransplantationinacutelyinfarctingmyocardium.EurJHeartFail.2005;7(5):730-738.QuZ,BalkirL,vanDeutekomJC,etal.Developmentofapproachestoimprovecellsurvivalinmyoblasttransfertherapy.JCellBiol.1998;142(5):1257-1267.LiuJ,HaoH,HuangH,etal.Hypoxiaregulatesthetherapeuticpotentialofmesenchymalstemcellsthroughenhancedautophagy.IntJLowExtremWounds.2015;14(1):63-72.MuraskiJA,FischerKM,WuW,etal.Pim-1kinaseantagonizesaspectsofmyocardialhypertrophyandcompensationtopathologicalpressureoverload.ProcNatlAcadSciUSA.2008;105(37):13889-13894.CondorelliG,DruscoA,StassiG,etal.Aktinducesenhancedmyocardialcontractilityandcellsizeinvivointransgenicmice.ProcNatlAcadSciUSA.2002;99(19):12333-12338.SussmanM."AKT"inglessonsforstemcells:regulationofcardiacmyocyteandprogenitorcellproliferation.TrendsCardiovascMed.2007;17(7):235-240.QuijadaP,TokoH,FischerKM,etal.Preservationofmyocardialstructureisenhancedbypim-1engineeringofbonemarrowcells.CircRes.2012;111(1):77-86.FischerKM,CottageCT,KonstandinMH,etal.Pim-1kinaseinhibitspathologicalinjurybypromotingcardioprotectivesignaling.JMolCellCardiol.2011;51(4):554-558.ZhaoY,HuJ,BuckinghamB,etal.Pim-1kinasecooperateswithserumsignalssupportingmesenchymalstemcellpropagation.CellsTissuesOrgans.2014;199(2-3):140-149.LandesT,MartinouJC.Mitochondrialoutermembranepermeabilizationduringapoptosis:theroleofmitochondrialfission.BiochimBiophysActa.2011;1813(4):540-545.SussmanMA.Mitochondrialintegrity:preservationthroughAkt/Pim-1kinasesignalinginthecardiomyocyte.ExpertRevCardiovascTher.2009;7(8):929-938.GustafssonAB,GottliebRA.Bcl-2familymembersandapoptosis,takentoheart.AmJPhysiolCellPhysiol.2007;292(1):C45-51.HammermanPS,FoxCJ,BirnbaumMJ,etal.PimandAktoncogenesareindependentregulatorsofhematopoieticcellgrowthandsurvival.Blood.2005;105(11):4477-4483.AhoTL,SandholmJ,PeltolaKJ,etal.Pim-1kinasepromotesinactivationofthepro-apoptoticBadproteinbyphosphorylatingitontheSer112gatekeepersite.FEBSLett.2004;571(1-3):43-49.MacdonaldA,CampbellDG,TothR,etal.Pimkinasesphosphorylatemultiplesites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