秀丽线虫生殖细胞凋亡检测

四川大学实验告题目：丽虫生殖胞亡检测一．实目的1.2.

掌握检测凋亡细胞的法学习使用荧光染料活染色的方法和步骤二．实原理1.秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans一种无毒无害可以独立生存的线虫。个体小，成体仅1.5mm长，为雌雄同（hermaphrodites个体仅占群体的可自体受精或性生殖；在下均生活史为3.5天，平均繁殖力为300-350个；但若与雄虫交配可产生多达以上的后代。1976年，SulstonHorvitz利秀丽隐杆线（Caenorhabditiselegans）研究发现其约13%体细胞在胚胎发育中注定死亡使得人们识到细胞凋亡的遗传础。2.荧光染料活体染色本实验使用吖啶橙（Acridineorange为染色剂该染料对细具有慢性毒性致癌性强由于凋亡细胞DNA片段化可结合更染料荧光显微镜下呈亮绿色可在荧光微镜下快速方便的检出，适用于多数品系。三．实材料及设备1/7

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各,3M9培NGM培养基普载暗吸荧四．实方法及步骤1.虫接种、同步2.取样：在12孔板培养板上每孔吸取900μL预先接入少量OP50的培养基，每孔铂金丝挑取培养20~30条成体线虫3.染色：向N2与ced-3品系每孔加入啶橙100μL,混匀后置于培养箱（光）染色。4.方法对照组观察：向ced-1::GFP系中加入1盐酸左旋咪唑，麻痹线虫后在荧光显镜下观察。2/7

四川大学实验告5.恢复已染色的线虫吸出于35mm培基中恢复45~60min，使摄入的含染料的OP50排出虫并置于荧光显微镜下观察6.观察述三品系用相同方法观察激发镜中，凋亡细胞位于生殖腺弯转弯附近亮黄染色时间长亮橙色（染色时间短核为均匀的暗绿色。五．实结果（一）对组：

组凋色凋亡细胞图方法对组荧光显镜观察结在方法对照组中可观察到GFP蛋白标记的凋亡细胞的阳性结果生殖腺臂弯转弯附近有亮绿色的空泡，外沿颜色最深内侧颜色浅该品系无需染色发出绿3/7

四川大学实验告色荧光的是标记蛋白GFP白聚集在凋亡细胞细胞膜上。（二）组图实验组光显微镜察结果在实验组中能观察到吖啶橙标记的凋亡细胞的阳性结果：呈现亮橙色的细胞结构，在20物镜中，凋亡细胞位于生殖腺臂弯转弯附近呈亮黄（染色时间长）或亮橙色（染色时间短未凋亡细胞核为均匀的暗绿色。（三）对组：4/7

四川大学实验告图阴性对组荧光显镜观察结由于凋亡基因缺陷品系以在阴性对照组中理论上不可能观察到凋亡细胞的阳性结果是在结果中仍然可以看到呈现亮橙色的细胞结构两种可能受损死亡的细胞染色时间过长啶橙杀死细胞，产生假阳性结果。六．实讨论1.实结论：本实验使用吖啶橙或GFP蛋白标记凋亡细胞其在荧光显微镜下显示为亮绿色2.讨一：实中有哪注意事？5/7

四川大学实验告1.吖啶橙有较强毒性长时间使用吖啶橙染色会导致细胞死亡染色超过90min增假阳性。2.吖啶橙有毒性，实过程中严禁直接接触皮肤，取用吖啶橙要在实验室专门的区，所有接触了吖啶橙的实验器械都要集中处理。3.在取用线虫时，动要轻缓，防止伤害线虫，如果确实感觉度太大，可以向培养中加入少量无菌水或培养基，然后用吸管吸取含有线虫的液以吸取线虫。3.讨二：如设置阳对照？答：线虫研究的常用系还包括与ced-5这两个品系特点是此果用这两个品系作为阳性对照以很容易在荧光显微镜下观察凋亡细胞。4.讨三：ced-1::GFP组的作用什么？答：该组为方法对照作用是证明本次实验所用的吖啶橙标记亡细胞的方法准确可跨膜蛋白在启动子作下，在鞘细胞表达，凋亡过程中，CED-1::GFP蛋白簇聚于凋细胞周围，不需要染，但用于其它品系需要进行遗传操作