绪论3酶分离纯化

六层析分离是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数等）的不同，使各组分在两相中的分布程度不同而达到分离。层析分离中一个相是固定的,称为固定相;另一个相是流动的,称为流动相;各组分移动速度步同,使不同组分分纯化;层析分离设备简单,操作容易;层析分离层析柱目前一页\总数六十九页\编于二十点表4-5层析分离方法层析方法分离依据吸附层析吸附力不同分配层析各组分在两相中分配系数不同离子交换层析离子交换剂上解离基团对离子亲和力不同凝胶层析各组分相对分子量不同亲和层析生物分子与配基间专一又可逆亲和力层析聚焦等电特性与离子交换层析特性结合目前二页\总数六十九页\编于二十点一、吸附层析(link)二、分配层析(link)三、离子交换层析(link)四、凝胶层析(link)五、亲和层析(link)附：视频动画1、色谱柱2、液相色谱生产上常用的层析分离方法go目前三页\总数六十九页\编于二十点一、吸附层析一个相中的物质在两相界面上密集现象称为吸附；吸附产生原因：固体表面分子与固体内部分子受的作用力不同；主要是范德华力。常用于酶分离纯化的：硅藻土、氯化铝、磷酸钙、羟基磷灰石、活性碳。不同物质吸附力、解析力不同，移动距离不同，而分离。利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合液中各组分分离。１、吸附层析原理目前四页\总数六十九页\编于二十点２、洗脱方法（１）溶剂洗脱法洗脱曲线洗脱液体积物质浓度（２）置换洗脱法ＡＢ洗脱液体积物质浓度目前五页\总数六十九页\编于二十点吸附层析（续）（３）前缘洗脱法ＡＡ＋ＢＡ＋Ｂ＋Ｃ洗脱液体积物质浓度目前六页\总数六十九页\编于二十点３、吸附剂与洗脱剂的选择（１）吸附剂的选择极性物易被极性表面吸附；溶解度大的越难吸附；吸附剂分无机和有机吸附；用于酶分离纯化的有硅藻土、氧化铝等，在低pH值、低离子强度下对酶有较强吸附作用，提高难度pH，离子强度即可洗脱。（２）洗脱剂的选择对于极性组分用极性大的溶液；注意点：洗脱剂不与吸附剂反应、对各组分溶解度大、流动性好，有一定纯度。back目前七页\总数六十九页\编于二十点二、分配层析分配系数指溶质在两互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两溶剂中浓度比值。通常用一种多孔性固体支持物吸着一种溶剂为固定相。不同溶质有不同分配系数，移动速度不同，从而分离。（１）纸上层析滤纸为支持物，以滤纸纤维结合水为固定相，有机相为流动相，分配系数不同而分离。（２）薄层层析固定相支持物铺在支持板上成为薄层，有吸附薄层层析，分配薄层层析。back目前八页\总数六十九页\编于二十点三、离子交换层析利用离子交换上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同物质分离。酶是两性物质，当溶液的pH值大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂进行层析分离，反之，用阳离子交换剂。用于酶分离纯化的常用离子交换剂离子交换树脂：大孔径离子交换树脂。离子交换纤维素：DEAE-纤维素，AE-纤维素，CMC（羧甲基纤维素）离子交换凝胶：DEAE葡聚糖凝胶、DEAE聚丙烯酰胺凝胶等。目前九页\总数六十九页\编于二十点1、离子交换剂的处理与装柱；2、上柱；3、冼脱和收集；4、离子交换剂的再生。２、离子交换层析的主要操作过程１、离子交换剂的选择与处理是含有若干活性基团的不溶性高分子物质；引入不溶性母体的活性基团可以是酸性基团，作为阳离子交换剂；也可是碱性基团，作为阴离子交换剂；平衡常数Ｋ；（１）离子交换剂的选择；（２）离子交换剂的处理。back目前十页\总数六十九页\编于二十点四、凝胶层析混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。凝胶层析是60年代初发展起来的一种快速而又简便的分离技术。目前它已被生物化学、分子生物学、生物工程学及医药学等有关领域广泛应用。从广义上说凝胶是一类具有三维空间多孔网状结构的高分子聚合物，如天然物质中的马铃薯淀粉及琼脂糖凝胶，人工合成品的葡聚糖凝胶及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等。制成颗粒状，装进凝胶层析柱使用。设备简单，操作方便（不需经过再生处理可反复使用）。不需要有机溶剂，以及对高分子物质有很高的分离效果，适于不同分子量的各种物质。凝胶颗粒目前十一页\总数六十九页\编于二十点McBain(1928)提出；Synge与Tiselins（1950）在解释凝胶层中的电泳和电渗现象时引用了分子筛的概念。此后发现在柱层析中也有这种现象，于是许多工作者尝试了一系列适用于生物高分子分离纯化用的分子筛。1959年Porath与Flodim将部分水解的葡聚糖凝胶交联，得到了商品名为交联葡聚糖（Sephadex)的分子筛。该分子筛具有许多良好的性能，在蛋白质的分离分析中已被广泛采用。分子筛概念凝胶是分子筛的一种目前十二页\总数六十九页\编于二十点１、凝胶层析的基本原理凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，加入欲分离的混合物，大量蒸镏水或其它稀溶液洗柱;分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，最后流出柱外。整个过程和过滤相似，故又名凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤等。由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，有人也称之为阻滞扩散层析、排阻层析等。目前十三页\总数六十九页\编于二十点Kd：分配系数，Kd小的物质先流出。Ve：冼脱体积，表示某一组分从进入导析柱到流出液中出现该组分高峰时，所需的冼脱液的体积。Vo：外体积。层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积Vi：内体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和。表征式讨论Kd=1Kd=00<Kd<1Ve=V0,组分足够大,不进入胶粒微孔,最先流出Ve=V0+Vi,可自由扩散,最后流出Kd小的先流出,Kd大的后流出目前十四页\总数六十九页\编于二十点凝胶层析的基本原理（续）大分子小分子在凝胶内流动速度差异理论：（１）流动分离理论（２）扩散理论组分冼脱体积与相对分子量（Ｍ）关系：ＫavLgM葡聚糖凝胶Ｇ２００葡聚糖凝胶Ｇ１００Ｋav：相对洗脱体积目前十五页\总数六十九页\编于二十点1、葡聚糖凝胶：以葡聚糖为单体聚合而成的高分子聚合物。商品名为Sephader，从G-10到G-200共有8种型号。2、琼脂糖凝胶：商品名为Sepharose（瑞典）Bib-gelA（美国）Gelarose（丹麦）。3、聚丙烯酰胺凝胶：商品名为Bio-gelP。２、凝胶的选择与处理目前十六页\总数六十九页\编于二十点加入的酶液量为凝胶床体积的10%左右，不超过30%；冼脱液体积为凝胶床体积的120%左右；冼脱液与干胶溶涨和装柱平衡用液相同。３、凝胶层析操作过程back目前十七页\总数六十九页\编于二十点五、亲和层析利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化。可用于亲和层析生物分子对酶-底物、酶-竞争性抑制剂、酶-辅酶。配基(ligand)作为固定相（成对互配生物分子的任何一方）的一方；母体（载体、担体）(matrix)不溶性，常用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等。１、亲和层析母体和配体配基母体样品样品目前十八页\总数六十九页\编于二十点机理图目前十九页\总数六十九页\编于二十点有兩大类力量，构成分子之间的专一性吸引力。一是兩个分子之间，其构形有如积木般的互补，会因为范德华力的关系，产生专一性吸引力另一則为两分子之间，因为某些基团间产生了二級鍵，所造成的吸引力。目前二十页\总数六十九页\编于二十点２、亲和层析方法（１）共价亲和层析（２）水层析（３）金属离子亲和层析（４）免疫亲和层析（５）染料亲和层析（６）凝集素亲和层析back目前二十一页\总数六十九页\编于二十点七电泳分离不同的物质，由于其带电性质及颗粒大小和形状不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不相同，因此可使它们分离。定义带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。原理水平电泳槽泳动度带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度目前二十二页\总数六十九页\编于二十点酸碱中F>0F=0H+H+OH-迁移原理图目前二十三页\总数六十九页\编于二十点其它因素（1）电场强度:指每厘米的电压降；（2）溶液pH值:决定了颗粒分子所带的净电荷；（3）溶液离子强度:越高,颗粒泳动越慢；（4）电渗:溶液对固体支持物的相对泳动；此外,缓冲液的黏度、温度对颗粒的泳动速度也有影响。目前二十四页\总数六十九页\编于二十点用途（酶工程领域）酶的纯度鉴定;酶分子量测定;酶等电点测定;小批量酶的分离纯化.水平电泳仪垂直电泳槽目前二十五页\总数六十九页\编于二十点发展形式目前二十六页\总数六十九页\编于二十点一、纸电泳二、薄层电泳三、薄膜电泳(link)四、凝胶电泳(link)五、等电聚焦电泳(link)常用的电泳技术毛細管電泳槽

back目前二十七页\总数六十九页\编于二十点常用的电泳技术（续）一、纸电泳以滤纸为支持体的电泳技术二、薄层电泳将支持体与缓冲液调成适当厚度的薄层进行电泳三、薄膜电泳以醋酸纤维等高分子物质制成的薄膜为支持体。back目前二十八页\总数六十九页\编于二十点四、凝胶电泳垂直管型盘状电泳；垂直板型电泳。定义以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支撑物（通常是聚丙烯酰胺凝胶）的电泳技术。形状單面垂直電泳槽目前二十九页\总数六十九页\编于二十点

1、聚丙烯酰胺凝胶的制备（操作）电泳染色脱色定性、定量（测量电泳迁移率）制备凝胶go电泳图谱目前三十页\总数六十九页\编于二十点胶膜放入底座胶膜固定在底座上

加胶放电梳

制胶完成取出

放入电泳槽中

安裝防护罩整套安裝完毕准备电泳

制胶图示Back目前三十一页\总数六十九页\编于二十点按装置不同分垂直管型盘状和垂直板型片状；按凝胶组成系统不同分：2、凝胶电泳分类（1）连续凝胶电泳；（2）不连续凝胶电泳;（3）梯度凝胶电泳;（4）SDS-凝胶电泳;目前三十二页\总数六十九页\编于二十点采用相同浓度的单体和交联剂，相同pH值和浓度的缓冲液制备成连续均匀的凝胶，然后在同一条件下进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂甲叉双两烯酰胺在催化剂作用下聚合而成；丙烯酰胺单体浓度对凝胶孔径有显著影响1、连续凝胶电泳公式目前三十三页\总数六十九页\编于二十点所使用的凝胶由二或三层不同孔径，不同pH的凝胶层组成;稀释品在电泳定性中浓缩成层后再进入分离胶分离。提高分率能力;使净电荷不同或净电荷相同但分子大小形状不同的物质分离.2、不连续凝胶电泳样品胶浓缩胶分离胶目前三十四页\总数六十九页\编于二十点凝胶层由上至下分别为：样品胶、浓缩胶、分离胶样品胶包含样品的大孔径凝胶浓缩胶用于样品浓缩成导线的大孔径凝胶，不含样品，其它与样品胶一样分离胶使样品中各组分电泳分离的孔径较小的凝胶浓缩胶成层，快离子、慢离子缘故目前三十五页\总数六十九页\编于二十点凝胶中的丙烯酰胺浓度由上至下形成由低到高的连续梯度，凝胶内部孔径由上至下逐渐减小。不同分子量的颗粒电泳后停留在与其大小相对应的位置上。适宜用于测定球蛋白等分子的分子量3、浓度梯度凝胶电泳目前三十六页\总数六十九页\编于二十点4、SDS-凝胶电泳在聚丙烯酰胺凝胶制备时，加入1~2%的SDS（十二烷基硫酸钠）而成。1967，Shapiro等发现。前述的凝胶电泳中，迁移率主要取决于蛋白电荷及分子大小及形状；SDS-凝胶电泳中，电泳迁移率取决于蛋白分子量大小，而与其分子形状及其所带电荷无关，故该方法主要用于测定蛋白质或酶的分子量。目前三十七页\总数六十九页\编于二十点两种不同形式的电泳为什么SDS-凝胶电泳会不受蛋白分子所带电荷及分子形状影响呢？SDS阴离子带负电荷，SDS-蛋白质复合物上结合大量阴离子掩盖了蛋白质间原来的电荷差别；SDS与蛋白结合后引起蛋白质构象变化，在水溶液中变成长椭圆形，短轴均为18A，长轴与蛋白分子量成正比。目前三十八页\总数六十九页\编于二十点故蛋白质电泳迁移率主要取决于其分子量大小,关系可用如下式表示:取对数:故测定某一蛋白质的分子量,只需比较该蛋白质与标准蛋白在SDS-凝胶电泳的迁移率即可.back目前三十九页\总数六十九页\编于二十点五、等电聚焦电泳在电泳系统中加入两性电解质载体（在电场中能够形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度），当不同蛋白质等进入该体系中即移动（聚焦）到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的蛋白质得以分离。

IEF原理pH连续增高pI点目前四十页\总数六十九页\编于二十点等电聚焦电泳分离酶蛋白pH大pH小目前四十一页\总数六十九页\编于二十点（1）分辩率高（等电点仅差0.01~0.02pH）；（2）防止扩散；（3）不管加样部位；（4）样品稀，重现性好；（5）测定等电点准确。等电聚焦电泳显著特点等电聚焦电泳缺点（1）要求无盐溶液，会产生沉淀；（2）对在等电点时溶解度低的组分不适。目前四十二页\总数六十九页\编于二十点等电聚集电泳的实现1、两性电解质载体2、稳定pH梯度形成3、支持pH梯度的介质4、聚集电泳的操作目前四十三页\总数六十九页\编于二十点1、两性电解质1966年Vesterberg等人合成载体两性电解质以后等电聚焦电泳才发展起来;为了获得稳定的pH梯度,必须要有性能优良的载体两性电解质,一般是由一系列带有不同电荷性质(因而有不同pI值)被称为Ampholyte的聚氨基酸组成；当酶试样加在凝胶的一端进行电泳时,由于Ampholyte分子量小,泳动快,先在电场中形成一梯度.蛋白质分子受电场作用在这一pH梯度中各自迁移到与其等电点相同的位置,经洗脱可得纯化样品.（1）足够缓冲力，控制好pH梯度；（2）足够导电力，且导电系数相同；（3）分子质量小，易分离；（4）与样品组分不同，不发生反应。目前四十四页\总数六十九页\编于二十点2、稳定pH梯度形成阳极槽酸液，阴极槽碱液+-H+OH-ABpIB>pIA目前四十五页\总数六十九页\编于二十点3、等电聚焦电泳介质（1）梯度溶液自由溶液在溶解中不添加稳定介质，而用机械方法使pH梯度保持稳定，防止对流；样品和载体两性电解质直接与溶液混合；采用卧式电泳槽或竖式电泳管进行。密度梯度采用密度梯度溶液使ph梯度稳定,防止对流和避免已分离组分混合;密度梯度溶液由重溶液和轻溶液在梯度混合器中配制而成,常用的是蔗糖和甘油重溶液、部分载体两性电解质和样品液置于混合室；轻液、部分载体两性电解质和样品置于贮存室；启动搅拌器打开阀门，引入等电聚焦柱内。（2）凝胶用聚丙烯酰胺等凝胶稳定pH梯度的等电聚焦电泳制备方法与上述凝胶电泳一样，但要加载体两性电解质；凝胶电泳两极缓冲液相同，而凝胶等电聚焦阳极采用酸溶液，阴极采用碱溶液。目前四十六页\总数六十九页\编于二十点4、聚集电泳的操作（1）pH梯度支持介质的制备；（2）电泳（400V～800V）；（3）分离组分检测或进行下一步的SDS凝胶电泳。目前四十七页\总数六十九页\编于二十点等电聚焦电泳的应用与SDS—PAGE组合成双向电泳；是蛋白质组学中重要的研究技术。10,000V10–25CPeltiercooling12-stripIPGtraysfor

7,11,17,and18cmstripsback目前四十八页\总数六十九页\编于二十点八萃取分离利用两物质在两相中溶解度不同而使其分离的技术。按两相组成不同分：一、有机溶剂萃取（link)二、双水相萃取（link)三、超临界萃取（link)四、反胶束萃取（link)back目前四十九页\总数六十九页\编于二十点有机溶剂萃取利用溶质在水和有机溶液中溶解度不同而分离。应注意变性，在低温下操作；过程：（1）选择适宜有机剂；（2）含组分和水溶液与预冷的有机剂混合，静止分层；（3）将水相与有机相分开；（4）除去有机剂，获得产物。有机相水相back目前五十页\总数六十九页\编于二十点双水相萃取两相为互不相溶的两水相，组分在两相中溶解度不同而分离。1、双水相形成将两种亲水性的聚合物都加在水溶液中,超过某一浓度产生两相;成相是由于聚合物间不相溶,利用生物物质在两相中不同的分配实现分离.目前五十一页\总数六十九页\编于二十点双水相萃取(续)关键点:制备好双水相系统;首先选好适宜溶质;其次配制好溶液浓度和比例.双水相相图:聚合物Q或盐/%聚合物P/%TBMT’B’C双节线系线V1/V2=BM/BT目前五十二页\总数六十九页\编于二十点双水相萃取(续)2、影响物质分配的因素两相组成；高分子聚合物分子量、浓度、极性；两相溶液比例；酶分子量、电荷、极性；温度、pH值等。亲合分配双水相萃取技术：乙二醇抗体人红细胞兔红细胞back目前五十三页\总数六十九页\编于二十点超临界萃取利用组分与杂质在超临界流体SCF中溶解度不同达到分离的一种萃取技术。PSCFGLST超临界流体：同温同压下同物质的液气相的物理特性不同，当温度和压力达到某特定数值时，气液特性趋于相同，此数值为临界点，当温度和压力超过此点时，两相变为一相，此态下之流体称为超临界流体。目前五十四页\总数六十九页\编于二十点超临界萃取（续）超临界流体物理特性和传质特性介于液体和气体之间：具有和液体同样的溶解能力，密度比气体大得多，扩散系数接近气体，黏度大低于液体的。溶解度大的物质溶解在超临界流体中，然后升温或降压，使其变成气态而得到所需物质。目前五十五页\总数六十九页\编于二十点CO2超临界萃取工艺(1)萃取.在萃取罐中进行;(2)分离.在分离罐中进行.萃取罐分离罐目前五十六页\总数六十九页\编于二十点超临界萃取（续）根据分离方法不同分离工艺有：1、等压分离通过温度变化进行溶质分离；2、等温分离通过压力变化使溶质分离；3、吸附分离利用吸附剂将溶质从超临界CO2中吸附分离。在超临界流体中加入少量夹带剂提高分离效果。back目前五十七页\总数六十九页\编于二十点反胶束萃取反胶束(reversedmicelle)，表面活性剂分散于连续有机相中形成的纳米尺度的聚集体，是透明、热力学稳定的系统。利用反胶束将酶蛋白从混合液中萃取出来的纯化技术。1977年Luisi等首先发现胰凝乳蛋白酶可以溶解于含双亲物质(表面活性剂)的有机溶剂中,超离心数据显示有机相中有反胶束的存在,同时,光谱分析(紫外2可见光谱、荧光光谱、旋光光谱)表明这一过程未引起酶的变性;1979年Luisi等考察了蛋白质溶液的pH值、蛋白质和双亲物质的浓度对蛋白质萃取率的影响及蛋白质在反胶束溶液中的光谱特性;1979年Menger和Yamada对反胶束溶液中酶的性质进行了研究。目前五十八页\总数六十九页\编于二十点反胶束萃取（续）1、胶束与反胶束的形成表面活性剂溶于水在水中聚集一起形成（正胶束）;极性基团在外,非极性基团在内,溶解非极性物质;表面活性剂(双亲物质)在非极性有机溶剂中自发聚集体,又称为反胶团、逆胶束(inversemicelle),极核具溶解极性物能力;反胶束作为液-液萃取法更具选择性;过程:酶从水相萃取到反胶束相;

酶蛋白从反胶束转移至第二水相.目前五十九页\总数六十九页\编于二十点反胶束萃取（续）2、表面活性剂由极性基团和非极性基团组成，分阳离子、阴离子和非离子型；如AOT（丁二酸乙已基酯磺酸钠）为阴离子型;反胶束萃取中，通常与某些有机剂一起使用。3、注意因素（1）水相pH,决定了蛋白表面带电基团离子化状态；（2）离子强度，决定了带电表面所赋予的静电屏蔽程度。降低蛋白质与反胶束带电界面的静电作用;降低了表面活性剂头部基团间静电斥力,导致反胶束颗粒变小.back目前六十页\总数六十九页\编于二十点九酶的结晶定义溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。结晶是蛋白酶分离纯化的一种手段，可获得较高纯度的酶。结晶的基本原理使母液中酶的溶解度慢慢降低，使处于稍饱和状态使酶结晶出来。目前六十一页\总数六十九页\编于二十点（1）酶液中酶的纯度50%以上；多次