DB52T 594-2010甘薯脱毒试管苗生产技术规程

甘薯脱毒试管苗生产技术规程2010-04-27发布2010-07-27实施贵州省质量技术监督局发布I前言 I 12规范性引用文件 13术语和定义 14脱毒试管苗的生产 24.1培养材料选择 24.2外植体选择 24.3茎尖剥离 24.4茎尖组织培养 24.5试管苗获得及增殖培养 24.6试管苗的病毒检测 24.7脱毒试管苗的试种鉴定 25脱毒试管苗的扩繁 25.1试管苗的转接 35.2脱毒试管苗增值培养条件 36扩繁苗的病毒检测 3 36.2病毒检测 37原原种的生产 3附录A(资料性附录)培养基配制方法 4A.1仪器和设备 4A.2试剂 4A.3培养基类型 4A.4培养及配制操作步骤 4本标准根据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分标准的编写与规则》给出的要求起草。1NY/T402-2000脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程24.3茎尖剥离4.3.1将表面冲洗干净的外植体置于超净工作台上，先用70%的酒精表面消毒10s,再用2%的次氯酸钠溶液消毒10min～15min后，无菌水冲洗3次-5次，置于无菌滤纸上吸去水分。4.3.2将消毒好的外植体置于超净工作台上的双目解剖镜下，用解剖针轻叶至露出茎尖生长点，在仅留两个叶原基(大小约0.2mm～0.4mm)处用解剖刀小心地将其切下，茎尖向上、切面向下置于试管或三角瓶内的茎尖诱导培养基(配制方法见附录A)中，封口、编号。将甘薯茎尖培养在温度23℃~28℃,光照强度2000Lx～3000Lx,每日光照12h～16h,相对湿度70%~增殖培养基(配制方法见附录A)内培养，培养条件是22℃~28℃,2000Lx～3000Lx,光照时间12h/d。按NY/T1200中的6.1.3执行，将部分检测3在超净工作台上，将培养30d～40d已形成5～8片展开叶的甘薯脱毒试管苗进行切段，每段留1～2片叶，叶面朝上插在固体增殖培养基(配制方法见附录A)上，置于培养室或培养箱内培养。培养室(培养箱)温度为22℃~28℃,光照强度为2000Lx～3000Lx,每日光照12h～16h,相对湿度按NY/T402中的4.1.1,4.1.2执行。4(资料性附录)培养基配制方法A.1仪器和设备A.1.1高压灭菌锅A.1.4双目实体解剖镜A.1.6酸度计或pH试纸A.1.7加热器A.1.8不锈钢锅A.1.9量筒、移液管A.1.10烧杯、玻璃棒和滴管A.1.11试管、三角瓶、培养瓶、耐高温封口材料或瓶盖A.1.12手术剪、手术刀、解剖针、镊子A.2.1茎尖组织培养所用试剂为分析纯级别，培养基用水为蒸馏水；试管苗增殖阶段所用试剂为分析或化学纯级别，水为自来水。A.2.2MS培养基母液成分及含量(mg/L)a)大量元素：硝酸钾(KNO3)1900,硝酸铵(NH4NO3)1650,硫酸镁(MgSO4)370,磷酸二氢钾c)铁盐：乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)37.3,硫酸亚铁(FeSO4·7H20)27.8d)有机物：甘氨酸2.0,盐酸硫胺素(VB1)0.4,盐酸吡哆醇(VB6)0.5,烟酸0.5,肌醇100A.2.3酒精、次氯酸钠(NaC1O)、盐酸(HC1)、氢氧化钠(NaOH)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸 A.2.4蔗糖、白糖、琼脂A.3培养基类型A.4培养及配制操作步骤5A.4.2配制MS培养基母液使用的水质为蒸馏水、重蒸馏水或无离子水A.4.3大量元素母液配制：按100倍的用量分别称取各大量元素，先单独定溶配制成母液。每升培养基取各种母液10ml。A.4.4微量元素母液配制：按100倍的用量分别称取各微量元素，单独溶解，再混合、定溶。每升培养基取此母液10ml。A.4.5铁盐配制：按100倍用量分别称取两种试剂，单独加热煮沸、再混合，混合后的溶液继续加热使之充分螯合，冷却后定溶备用。每升培养基用铁盐母液10ml。A.4.6有机物配制：以100倍用量分别称量分别溶解，再混合、定溶。每升培养基取此母液10ml。A.4.7植物激素配制A.4.8萘乙酸NAA配制：按0.1mg/ml浓度适量称取萘乙酸NAA,先用少许95%酒精使之溶解，再用蒸馏水定溶，置于4OC冰箱贮藏待用。A.4.9赤霉素GA3配制：按0.05mg/ml浓度适量称取赤霉素GA3,先用少许95%酒精使之溶解，再用蒸馏水定溶，置于4OC冰箱贮藏待用。A.4.106-苄氨基腺嘌呤6-BA配制：按0.5mg/ml浓度适量称取6-苄氨基腺嘌呤6-BA,用少许1NHC1使之溶解，再用蒸馏水定溶，置于4OC冰箱贮藏待用。a)溶化琼脂：按需量称取琼脂入不锈钢锅内，加入所需配制培养基体积一半的水，加热溶化琼脂b)加母液：将称量好的各种母液、糖加到溶解好的琼脂液中，继续加热并搅拌，待糖溶解，加水至所需配制培养基体积，搅拌均匀。c)调pH值：用酸度计或精密pH试纸测量所配制培养基的pH值，加0.1NHC1或NaOH溶液调节培养基pH值在5.8-6.0之间