流感疫苗生产及研究进展

流感疫苗生产及研究进展目前一页\总数七十一页\编于九点

内容病毒性灭活疫苗概述1流感和流感病毒2流感疫苗生产工艺33流感疫苗研发44目前二页\总数七十一页\编于九点病毒性灭活疫苗概述定义及分类病毒接种和培养采用物理或化学的方式将病毒灭活其他的生产步骤成品培养基质流感疫苗：鸡胚出血热及森脑疫苗：原代地鼠肾细胞狂犬疫苗：Vero细胞灭活方法：加热灭活剂（福尔马林等）纯化：纯化全病毒疫苗裂解：裂解疫苗亚单位：亚单位疫苗纯化全病毒疫苗：冻干人用狂犬病疫苗出血热、森脑----含氢氧化铝佐剂裂解：流感病毒裂解疫苗灭活疫苗：称死疫苗，是指利用加热或甲醛等理化方法将人工大量培养的完整的病原微生物杀死，使其丧失感染性和毒性而保持免疫原性，并结合相应的佐剂而制成的疫苗。目前三页\总数七十一页\编于九点长春公司的病毒性灭活疫苗

工艺流程名称病毒培养病毒纯化病毒裂解病毒灭活半成品配制及分包装冻干人用狂犬病疫苗基质：Vero细胞培养方式：生物反应器超滤浓缩；柱层析（分子筛）无灭活剂：β-丙内酯冻干双价肾综合征出血热疫苗森林脑炎灭活疫苗基质：原代地鼠肾细胞方式：转瓶超滤浓缩；柱层析（分子筛）无灭活剂：甲醛含铝佐剂流感病毒裂解疫苗基质：鸡胚方式：孵化间超滤浓缩；蔗糖密度区带离心裂解剂：TritonX-100灭活剂：甲醛无硫柳汞目前四页\总数七十一页\编于九点两种灭活剂的比较简要介绍灭活机理优缺点甲醛甲醛，化学式HCHO，称蚁醛。无色气体，有特殊的刺激气味，对人眼、鼻等有刺激作用。既可作用于病毒含氨基的核苷酸碱基（如A,G,U），又可作用病毒壳蛋白。1）病原体蛋白的抗原性严重破坏，可能有病原体存活；2）灭活时间长；3）易受温度、pH、浓度、是否存在有机物、病原体的种类和含氮量等因素影响；4）残留的游离甲醛，注入机体后，会产生制激性反应。β-丙内酯一种杂环类化合物(C3H4O2)，沸点155℃，常温下是无色粘稠状液体，对病毒具有很强的灭活作用。作用于病原体DNA或RNA，改变病毒核酸结构达到灭活目的，而不直接作用于蛋白。

1）不破坏病毒的血凝素抗原,保持病毒良好的免疫原性；2）灭活时间短；3）其水解产物对机体无害，接种反应轻。目前五页\总数七十一页\编于九点常用的裂解剂简要介绍机理TritonX-100聚乙二醇辛基苯基醚,是一种非离子型表面活性剂（或称去污剂）它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。TritonN-101聚乙二醇(壬基苯基)醚,是一种非离子型表面活性剂（或称去污剂）溶解脂质

CTAB十六烷基三甲基溴化铵,阳离子表面活性剂，是一种阳离子去污剂与非离子及两性离子表面活性剂有良好的配位性，对多种油脂具较好的乳化作用,有轻微脱脂作用.目前六页\总数七十一页\编于九点流行性感冒（Influenza）即流感，是由甲（A）、乙（B）、丙（C）三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染病。常造成不同程度的流行，对人类的健康造成巨大的威胁。慢性病恶化、继发感染、其它……-痛苦不堪-缺课或缺勤-就医-使用抗生素-住院-死亡流感流感和流感病毒目前七页\总数七十一页\编于九点流感的流行特点是在短期内突然发生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，包括世界大流行，局部暴发流行及散发。具有一定的季节性：温、寒带地区常在冬、春季节流行，但热带和亚热带地区任何季节都可以流行。流感病毒传播迅速、流行广泛、抗原易变异，人群的特异性免疫状况不稳定。发病率高，并伴有一定的死亡率。最高的为青少年，高危人群为年迈体弱或带有慢性疾病患者。每次流感流行后在人群中总要造成不同程度的超额死亡。流感患者和隐性感染者是流感的主要传染源。从潜伏期末到发病的急性期（约7天）都有传染性。死亡率升高超过一定的正常临界水平目前八页\总数七十一页\编于九点流感病毒形态结构目前九页\总数七十一页\编于九点流感病毒的超细微结构照片流感病毒电镜照片流感病毒形态结构目前十页\总数七十一页\编于九点目前十一页\总数七十一页\编于九点目前十二页\总数七十一页\编于九点目前十三页\总数七十一页\编于九点目前十四页\总数七十一页\编于九点目前十五页\总数七十一页\编于九点

甲型流感病毒基因组各节段的大小与功能节段长度（bp）编码蛋白主要功能RNAI2341PB2RNA转录酶；识别和结合来源于宿主细胞的帽子RNA22320PB1RNA转录酶主要成分；启动转录和RNA合成延伸RNA32233PA具有解旋酶话性RNA41778HA结合靶细胞受体，诱导病毒与靶细胞融合诱导中和抗体，凝集红细胞RNA51565NP与基因组RNA结合，参与形成核糖核蛋白（RNP）颗粒RNA61413NANA活性；水解细胞多糖受体，协助新生病毒颗粒从被感染宿主细胞表面游离下来，促使子代病毒释放RNA71027M1、M2病毒基质膜蛋白，有保护作用；质子通道作用RNA8890NS1、NS2非结构蛋白，抑制宿主细胞蛋白合成或参与

vRNA合成目前十六页\总数七十一页\编于九点流感病毒的理化特性

流感病毒对热敏感，通常56℃30min被灭活，但有些毒株56℃90min被灭活。

最适PH为可被紫外线灭活因其为带囊膜的病毒，故对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂敏感。目前十七页\总数七十一页\编于九点流感病毒的变异原因：流感病毒结构特点天然宿主的广泛存在密切接触方式：抗原漂移（Antigenicdrift）

--小变异，同一亚型

--基因点突变所致

--引起流行抗原转换（Antigenicshift）

--大变异

--基因片段交换

--引起大流行目前十八页\总数七十一页\编于九点抗原漂移（AntigenicDrift）RNASialicacidAntibodiesHemagglutininNeuraminidaseHA和/或NA基因的点的变异频繁发生A型和B型发生目前十九页\总数七十一页\编于九点抗原转换（Antigenicshift)人类和动物毒株的RNA发生交换(HA和/或NA基因的全球性变异),导致新的亚型出现少见但后果严重只在A型出现目前二十页\总数七十一页\编于九点191819401960198020002020H1N1H2N2H3N2H1N1H1N11918SpanishInfluenzaH1N11957AsianInfluenzaH2N21968HongKongInfluenzaH3N22009NovelInfluenzaH1N1H71980198519952005197519962002H520021997H91999流感的流行情况目前二十一页\总数七十一页\编于九点抗原漂移所引起的历史上的流感流行PB1HANAPB1NA目前二十二页\总数七十一页\编于九点NEnglJMed10.1056/nejmoa0903810甲型H1N1流感病毒4种不同来源的基因4differentgenes:北美猪流感病毒NorthAmericaswine欧亚猪流感病毒Asia/Europeswine人流感病毒Humaninfluenza禽流感病毒(非H5)Avian(Non-H5)目前二十三页\总数七十一页\编于九点流感的实验室诊断目前二十四页\总数七十一页\编于九点流感已成为全球患病人数最多的一类疾病。接种流感疫苗是目前预防和控制流感最经济、最有效的手段，已被广泛采用，并证明有效率达到70％以上。

流感疫苗目前二十五页\总数七十一页\编于九点目前，使用的流感疫苗是三价的，包括两种甲型（H1N1，H3N2）和一种乙型(B)流感病毒抗原成分，应用最广泛的有：

灭活：Inactivatedinfluenzavaccine（IIV）：6月以上减毒：Liveattenuatedinfluenzavaccines（IAIV）：2-49岁

当前主要应用的疫苗种类目前二十六页\总数七十一页\编于九点

灭活疫苗种类和生产工艺全病毒疫苗裂解疫苗亚单位疫苗第一代全病毒价格较低，但副反应较高，部分人群不适宜接种，已逐渐淘汰第二代裂解接种效果好，临床副反应较少，适合各年龄段人群接种第三代亚单位有效抗原含量高，更安全，价格较高灭活疫苗种类目前二十七页\总数七十一页\编于九点3-4月份10-11月份WHO发布毒株生产企业获得和培育毒株疫苗生产销售每年世界卫生组织根据上一年流感病毒流行情况预测下一年度流感病毒流行株并向各生产企业发布从WHO合作实验室获得病毒疫苗株，并将病毒在鸡胚内培养，制备毒种将病毒接种到鸡胚内培养，收获尿囊液，经纯化、灭活、裂解后制备成疫苗2月份9月份5-9月份12-次年4月9月-次年2月份5月-9月生产周期5-6个月生产工艺目前二十八页\总数七十一页\编于九点生产工艺目前二十九页\总数七十一页\编于九点单价原液制备目前三十页\总数七十一页\编于九点毒种和病毒尿囊液制备毒种MOI接种量温湿度培养时间通风温度时间颜色量目前三十一页\总数七十一页\编于九点选胚目前三十二页\总数七十一页\编于九点目前三十三页\总数七十一页\编于九点目前三十四页\总数七十一页\编于九点目前三十五页\总数七十一页\编于九点目前三十六页\总数七十一页\编于九点接种目前三十七页\总数七十一页\编于九点目前三十八页\总数七十一页\编于九点培养目前三十九页\总数七十一页\编于九点收获目前四十页\总数七十一页\编于九点纯化目前四十一页\总数七十一页\编于九点目前四十二页\总数七十一页\编于九点裂解目前四十三页\总数七十一页\编于九点目前四十四页\总数七十一页\编于九点目前四十五页\总数七十一页\编于九点目前四十六页\总数七十一页\编于九点目前四十七页\总数七十一页\编于九点目前四十八页\总数七十一页\编于九点产品名称检定项目药典标准主代种子无菌检查无菌生长血凝滴度不低于1：320支原体检查符合规定鉴别试验采用交叉血凝抑制法，P/N不低于8病毒滴度不低于6.5LgEID50/ml外源性禽白血病病毒检测阴性外源性禽腺病毒检测阴性工作种子无菌检查无菌生长血凝滴度不低于1：320支原体检查符合规定鉴别试验采用交叉血凝抑制法，P/N不低于8病毒滴度不低于6.5LgEID50/ml质量控制目前四十九页\总数七十一页\编于九点中间产品质量控制中间品检定项目长春公司企业注册标准病毒收获液微生物限度<105CFU/ml沙门氏菌阴性血凝滴度≥1:160细菌内毒素<10EU/ml蛋白含量≤3.5mg/ml病毒浓缩液蛋白含量≤10mg/ml细菌内毒素<160EU/ml病毒纯化液蛋白含量≥2.0mg/ml病毒裂解

纯化液蛋白含量≥0.5mg/ml病毒灭活

纯化液细菌内毒素＜0.2EU/ugHA灭活验证实验符合规定微生物限度<10CFU/ml目前五十页\总数七十一页\编于九点单价病毒原液质量控制单价病毒原液检定项目长春公司企业注册标准鉴别实验抗原性与推荐的病毒株相一致血凝素含量≥90ug/ml蛋白含量不高于血凝素含量的4.0倍无菌检查符合规定病毒裂解

效果检查病毒颗粒应裂解完全。每次更换流感病毒毒株后生产的前三批单价病毒液须进行该项检查。目前五十一页\总数七十一页\编于九点某些病毒能够与人或动物的红细胞发生凝集，这称之为红细胞凝集反应（HA）。这种凝集反应被加入的特异性血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验（HI）。血凝和血凝抑制试验目前五十二页\总数七十一页\编于九点血凝和血凝抑制试验目前五十三页\总数七十一页\编于九点血凝素含量检测（单扩）目前五十四页\总数七十一页\编于九点标准直线目前五十五页\总数七十一页\编于九点半成品质量控制半成品检定项目长春公司企业注册标准无菌检查符合规定血凝素含量每1ml中各型流感病毒血凝素含量应为配制量的80%～120%裂解剂残留量≤150ug/ml目前五十六页\总数七十一页\编于九点成品检测指标成品检定项目长春公司规程标准鉴别实验抗原性与推荐的病毒株相一致外观微乳白色液体，无异味装量应不低于标示量pH值6.8～7.8血凝素含量每1ml中各型流感病毒血凝素含量应为配制量的80%～120%游离甲醛含量≤50ug/ml卵清蛋白含量≤100ng/ml总蛋白含量≤350ug/ml,不高于血凝素总含量的3.5倍细菌内毒素≤20EU/ml抗生素残留量≤50ng/剂无菌检查符合规定异常毒性检查符合规定目前五十七页\总数七十一页\编于九点目前广泛应用流感疫苗季节性四价流感疫苗细胞基质流感疫苗喷鼻减毒活疫苗基因工程流感疫苗病毒样颗粒、病毒载体及DNA流感疫苗通用流感疫苗研发与展望目前五十八页\总数七十一页\编于九点疫苗效果影响因素目前五十九页\总数七十一页\编于九点接种疫苗是当今预防和控制流感发生和流行最有效的手段。目前，使用的流感疫苗是三价的，包括两种甲型（H1N1，H3N2）和一种乙型(B)流感病毒抗原成分，应用最广泛的有：

灭活：Inactivatedinfluenzavaccine（IIV）：6月以上减毒：Liveattenuatedinfluenzavaccines（IAIV）：2-49岁目前广泛应用的流感疫苗目前六十页\总数七十一页\编于九点近年获批上市的新型流感疫苗充实一下新型流感疫苗表疫苗种类商品名厂家批准地批准时间剂量对象备注佐剂疫苗Fluad®Novartis欧洲1997—≥65YMF59/AS03皮内注射疫苗Intanza®/IDflu®SanofiPasteur欧洲20099μg/株15μg/株18-59Y≥60Y—高剂量疫苗Fluzone®SanofiPasteur美国200960μg/株≥65Y—细胞培养疫苗Influvac®TCSolvayPharmaceuticalsInc荷兰2001——MDCKOptaflu®Novartis欧洲2007—亚单位＞18YMDCKFlucelvax®Novartis美国2012—亚单位＞18YMDCKCeltura®Novartis欧洲—H1N1pdm09亚单位—MF59Celvapan®Baxter欧洲—H1N1pdm09全病毒＞6MVEROPreflucel®Baxter美国—裂解18-49YVERO重组HA疫苗FluBlok®ProteinScience—201345μg/株18-49Y—目前六十一页\总数七十一页\编于九点1985年后在全球流行的原单一谱系B型流感病毒B／Yamagata，逐渐演变为二种抗原性截然不同的B／Victoria和B／Yamagata二个谱系交替或者一个谱系为主的混合流行。这二个谱系B型病毒之间很少或者没有交叉保护甲型和乙型流感病毒血凝素基因进化树四价流感疫苗背景目前六十二页\总数七十一页\编于九点批准时间批准单位生产厂家疫苗名称疫苗类型使用方式适用人群2012年02月美国FDA阿斯利康旗下子公司MedImmuneFluMistQuadrivalentvaccine减毒活疫苗鼻腔喷雾2-49岁2012年12月美国FDA葛兰素史克公司Fluarix裂解疫苗肌肉注射3岁以上2013年08月美国FDA葛兰素史克公司FluLavalQuadrivalent裂解疫苗肌肉注射3岁以上2013年06月美国FDA赛诺菲巴斯德