紫外可见分光光度法

第九章紫外-可见分光光度法学习目标1.理解光的本质及物质对光的选择性吸收；2.掌握光的吸收定律及其应用条件；3.掌握分光光度计的基本结构、工作原理及使用方法；紫外-可见分光光度法的定性定量分析方法及应用；4.了解紫外-可见分光光法特点及其应用领域，显色反应及显色条件的选择。一、光的本质第一节光的本质与电磁波谱光的本质是电磁辐射（又称为电磁波），具有波动性和粒子性。光是一种能以巨大速度通过空间、不需要传播媒介的粒子流。光的折射光的衍射光能发生反射、折射、衍射、干涉和偏振，说明光具有波动性。光的波动性可用参数（光速c、波长λ、频率ν和波数σ）来描述：1.光的波动性光的反射

光与物质作用产生吸收、发射和光电效应，说明光具有粒子性。光微粒的能量E与光速c、波长λ、频率ν和波数σ之间的关系符合：光的发射光的吸收光电效应2.光的粒子性所有的电磁波在本质上都相同，其区别仅在于波长（或频率）不同。将不同的电磁波按波长顺序排列起来得到电磁波谱。3.电磁波谱波长

长

短电磁波谱无线电波微波红外线可见光紫外线X射线ϒ射线波段无线电波微波红外线可见光紫外线x射线ϒ射线波长(米)103

10-2

10-5.5×10-6

10-8

10-1010-12对应尺度物体频率(Hz)电磁波谱类比表能量低

高

可见光是人眼能感觉到的光，其波长大约在400-760nm之间。红橙黄绿蓝紫青可见光红橙黄绿靛蓝紫青400500600700760可见光nmnmnmnmnm可见光与紫外光仅仅是电磁波谱的一部分。二、光的基本概念1.可见光光的颜色波长范围（nm）光的颜色波长范围（nm）红色760~650青色500~480橙色650~610蓝色480~450黄色610~560紫色450~400绿色560~500

各种可见色光的波长范围可见光区内（400∽760nm）不同颜色的光具有不同的波长。10nm～200nm的紫外辐射被大气吸收，在空气中不能传播。

故用于分析的是200nm～400nm之间的近紫外光。紫外光是电磁波谱中10nm～400nm辐射的总称，不能引起人们的视觉。2.紫外光3.单色光与复合光●单色光：单一波长的光。●复合光：由不同波长的光混合而成的光。4.互补色光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。白光蓝黄青蓝橙白光红青紫绿光的互补示意图互补色光三、物质对光吸收的选择性物质所呈现的颜色是由于白光照射时，物质选择性地吸收了某种色光而显示出其互补色光颜色。不同的物质颜色不同，说明物质对光的吸收具有选择性，这就是分光光度法分析的理论基础。【互动与思考】紫外线对于皮肤有损伤，紫外线可分为UVA(320～400nm)、UVB(290～320nm)、UVC(100～290nm)三种，哪种紫外线的能量大？UVAUVBUVC第二节光谱分析法概述根据物质发射的电磁辐射或电磁辐射与物质的相互作用所建立起来的分析方法，统称为光学分析法。光学分析法光谱分析法非光谱分析法一、光学分析法利用物质分子内部发生能级跃迁所产生的光谱进行分析（1）

按作用物质的微观形式分类:利用气态原子（离子）内外层电子能级跃迁所产生的光谱进行分析1.光谱分析法的分类光谱分析法原子光谱法分子光谱法线状光谱■原子光谱法分析基础：以测量气态原子（或离子）外层电子能级跃迁所产生的光谱。类型：原子发射光谱法、原子吸收光谱法、原子荧光光谱法等。特征：线状光谱。分析基础：以分析分子内部能级跃迁所产生的光谱。■分子光谱法带状光谱类型：分子吸收光谱法、分子荧光光谱法等。特征：带状光谱。光谱分析法吸光光谱法发射光谱法(2)按光与物质相互作用方式分类:分析基础：物质对不同波长的辐射选择性吸收。吸收光谱法的类型：原子吸收光谱法紫外-可见分光光度法红外分光光度法磁共振波谱法■吸收光谱法

分析基础：以物质受辐射作用发生跃迁所发射的辐射进行分析。■发射光谱法原子发射光谱原子荧光光谱分子荧光光谱发射光谱法的类型：二、紫外-可见分光光度法200nm400nm600nm700nm760nm紫外-可见光300nm500nm利用物质与紫外-可见光（200～760nm）的相互作用而建立起来的分析方法叫紫外-可见分光光度法，它是光谱分析法中的一种。■紫外-可见分光光度法特点：●灵敏度高、准确度高●选择性好●操作简便、测定迅速●应用范围广泛【互动与思考】123紫外分光光度法是发射光谱法还是吸收光谱法？其利用的是什么波长范围内的光？可见光分光光度法是发射光谱法还是吸收光谱法？其利用的是什么波长范围内的光？紫外－可见分光光度法利用的是什么波长范围内的光？第三节吸光度与透光率一束光通过溶液时，光的主要去向有几种？被吸收被反射被透射一、透光率透射光强度It与入射光强度I0之比称为透光率或透光度。透光率通常用符号“T”来表示，常用百分数。入射光I0透射光It物质的透光率越大，则表明物质吸收的光越少。物质的透光率越大，则表明物质吸收的光越少，见下图：T=0%，光全部被吸收入射光I0入射光I0透射光It可见，透光率T的取值范围：0.0%～100.0%。T=100%，光全部透过二、吸光度透光率倒数的对数称为吸光度，用“A”表示，即：入射光I0透射光ItA越大，则T越小表明物质对光的吸收越强T值范围：0.0%～100.0%A值范围为：0%～∞1.透光率与吸光度的大小变化关系透过光吸收光透光率吸光度透光率吸光度三、透光率与吸光度的关系2.透光率与吸光度的定量换算关系全部吸收，T→0%，A→∞入射光全部透过，T→100%，A→0透射光入射光【示例】光线通过维生素B2溶液的透光率是50%，求维生素B2溶液的吸光度是多少？解：根据公式：得到：答：维生素B2溶液的吸光度是0.301。

物质的吸光度与透光率是否是一种简单的反比例关系？单色光波长(nm)吸光度值λ1A1λ2A2λ3A3λ4A4………………λnAn改变入射光波长保持溶液的浓度和厚度不变，测定溶液对不同波长单色光的吸光度，以波长为横坐标，测得的相应吸光度为纵坐标，绘制吸光度随波长变化的曲线称为吸收光谱曲线（简称为吸收光谱）。第四节吸收光谱曲线一、吸收光谱曲线的定义吸收光谱曲线物质的吸收光谱曲线物质的吸收光谱曲线上面有很多特征信息，这些特征信息称之为特征值。1.吸收峰二、吸收光谱曲线上的特征值吸光度A0.80.60.40.2300400500600700波长（nm）λmax1λmax2λmax3吸收峰吸收光谱曲线上比左右相邻都高之处称为吸收峰；吸收峰所在的波长为最大吸收波长，用“λmax”表示。吸收光谱曲线上比左右相邻都低之处称为吸收谷；吸收谷所在的波长为最小吸收波长，用“λmin”表示。2.吸收谷吸光度A0.80.60.40.2300400500600700波长/nmλmin2λmin1吸收谷物质的吸收光谱曲线吸收光谱曲线上不成峰形、形状类似肩膀的小曲折称为肩峰；肩峰所在的波长用“λsh”表示。3.肩峰吸光度A0.80.60.40.2300400500600700波长λ（nm）末端吸收肩峰λsh物质的吸收光谱曲线4.末端吸收在曲线上短波长端强吸收而不呈峰形的部分。1.吸收光谱是物质固有的特征，不同物质的吸收光谱曲线一般不同。吸光度A0.80.60.40.2300400500600700波长/nmAB红色---物质B的吸收曲线黑色---物质A的吸收曲线不同物质的吸收光谱曲线三、吸收光谱曲线的意义2.同种物质的吸收光谱特征值（λmax、λmin

、λsh等）必定相同。同一物质不同浓度的吸收光谱曲线吸光度A0.80.60.40.2300400500600700波长/nmACB

物质在一定条件下的吸收光谱是一定的。因此，吸收光谱及其特征值是定性分析的依据。1.作为定性分析的依据如：对某提取物的鉴别

曲线的形状曲线的拐点

最大吸收波长

最小吸收波长

吸收峰数目

吸收峰强度

物质在一定条件下的吸收光谱是固定的。因此，通过对比吸收光谱及其特征值可以进行定性分析，吸收光谱的特征值包括：四、吸收光谱曲线的应用2.确定定量分析中的最佳测定波长吸收曲线上的最大吸收波长(λmax)往往作为定量分析的最佳测定波长。KMnO4吸收曲线400500

600650波长λ/nm525吸光度A0.80.60.40.2λmax如：实际测定KMnO4的浓度时，选择在525nm处测定样品溶液的吸光度。约翰·朗伯，德国数学家、天文学家、物理学家。奥古斯特·比尔，德国物理学家、数学家。第五节光的吸收定律

18、19世纪，朗伯（Lambert）和比尔（Beer）分别研究了溶液对光的吸收与液层厚度及溶液浓度的定量关系，奠定了分光光度法的理论基础，被后人称为朗伯-比尔定律。朗伯-比尔定律，又称为光的吸收定律，是所有光学分析法的理论基础。平行单色光通过吸光性物质的溶液时，在溶液的浓度、入射光波长、强度及溶液的温度不变的情况下，溶液的吸光度A与溶液的厚度L成正比，即：1.朗伯定律式中，A—吸光度；L—液层的厚度L吸光度A单色光A＝K·L一、光的吸收定律A＝K·C吸光度A入射光

浓度C平行单色光通过吸光性物质的溶液时，在液层厚度、入射光波长、强度及溶液温度不变的情况下，溶液的吸光度A与溶液的浓度C成正比，即：2.比尔定律式中，A—吸光度；C—溶液的浓度A＝K·C·LL入射单色光浓度C当平行的单色光通过均匀、无散射的含有吸光性物质的溶液时，在入射光波长、强度及溶液温度不变的情况下，溶液的吸光度A与溶液的浓度C及液层厚度L的乘积成正比，即：3.朗伯-比耳定律式中，A—吸光度；K——吸光系数；

C—溶液的浓度；L——液层的厚度二、朗伯-比耳定律的适用范围1.朗伯-比耳定律适用的两个前提●溶液必须是稀溶液（c＜0.01mol/L）稀溶液单色光入射光●入射光必须是单色光入射光2.适于测定的样品范围适用于测定均匀、无散射的溶液。也适用于均匀、无散射的固体样品。还适用于均匀、无散射的气体样品。3.适用的光谱范围朗伯---比耳定律是各种分光光度法进行定量分析的理论依据。不仅适用于可见光，也适用于紫外光，还适用于红外光。4.适用于多组分溶液的测定溶液的吸光度具有加和性，即若溶液中含多种吸光性物质，则溶液的吸光度等于各吸光性物质的吸光度总和。abcA(a+b+c)=Aa+Ab+Ac三、吸光系数1.吸光系数的物理意义吸光系数是表征物质对某波长单色光吸收程度的参数，指的是单位浓度、单位厚度的溶液吸光度。吸光系数通常有两种表示方法：摩尔吸光系数和百分吸光系数。吸光系数是物质的特征常数，其大小只与吸光性物质的本性有关。是指在入射光波长一定时，溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，所测得的吸光度，常用ε表示，单位是L/（mol·cm）。■摩尔吸光系数（ε）2.两种常用的吸光系数（L•mol-1•cm-1）

实际进行分光光度法测定时，一般要求ε≥103。强吸收(ε≥104)弱吸收(ε≤102)中强吸收(102≤ε≤104)是指在一定波长下，当液层厚度为1cm，溶液浓度为1%（g/100ml）时，所测得溶液的吸光度，用“

”表示，单位是100ml/g·cm。（100ml/g·cm）■百分吸光系数()■摩尔吸光系数与百分的换算关系：式中，M——物质的摩尔质量；溶液的浓度单位c吸光系数K朗伯-比耳定律公式物质的量浓度(mol/L)摩尔吸光系数()物质的质量浓度(g/100ml)百分吸光系数()不同的物质对同一单色光有不同的吸光系数，同一物质对不同波长的单色光下也会有不同的吸光系数，吸光系数是物质的特征常数，只与物质的本性有关，可作为定性的依据。3.吸光系数在朗伯---比耳定律中的运用【示例】氯霉素（M=323.15g/mol）溶液在278nm处有最大吸收，用纯品配制100ml含有2.00mg的溶液，以1cm厚的比色皿在278nm处测得透光率T为24.3%。求氯霉素的百分吸光系数和摩尔吸光系数。解：根据吸光度定义，得：由百分吸光系数和摩尔吸光系数的换算关系得：根据朗伯-比尔定律：第六节紫外-可见分光光度计的基本结构在紫外—可见光区(200∽760nm)范围内，能任意选择不同波长的单色光测定溶液吸光度（或透光率）的仪器。一、紫外-可见分光光度计的结构光源单色器吸收池检测器显示器■作用：提供入射光发射150～400nm的连续光谱（适用于紫外光区）氢灯（氘灯）气体光源光源钨灯（卤钨灯）固体光源发射360～800nm的连续光谱（适用于可见光区）■种类：固体光源和气体光源■作用：将光源发出的复合光色散成所需波长的单色光。光栅棱镜2.单色器■种类：光栅和棱镜进出光狭缝色散元件准直镜■组成单色器色散示意图光源复合光复合光单色光单色光反光镜色散原件准直镜进光狭缝出光狭缝透镜■作用：盛装待测的样品溶液和参比溶液。■使用要求：匹配性(两个吸收池对光的吸收和反射应一致)。（适用于可见光区）玻璃比色皿GG（适用于紫外光区）石英比色皿QQ玻璃材质（“G”

标志）石英材质（“Q”

标志）3.吸收池（比色皿）■种类：玻璃和石英■作用：将通过溶液后的透射光强度大小转变为光电信号进行检测。光电倍增管透射光入射光入射光透射光二极管阵列4.检测器■种类：光电池、光电倍增管、二极管阵列等。■作用：将检测器检测得到的信号进行处理后以适当的形式（吸光度或透光率）显示出来。5.显示器显示器第七节紫外-可见分光光度法的定性定量分析一、测量条件的选择1.测定波长的选择

选择在被测物质的最大吸收波长处（λmax）进行吸光度测定。测定波长吸光度

A波长λ（nm）λmax1λmax22.吸光度（透光率）值的选择吸光度A控制在0.2～0.7的范围(透光率T控制在20%～65%之间)。试样显色剂溶剂吸光物质参比液选择无吸收无吸收透明吸收溶剂基体吸收无吸收透明吸收不加显色剂的试液无吸收吸收透明吸收显色剂+溶剂基体吸收吸收透明吸收显色剂+溶剂+待测组分的掩蔽剂参比溶液应根据待测溶液的组成和性质来选择，常有以下几种：3.参比溶液的选择1.定性的理论依据不同的物质其吸收光谱的形状及其特征值不同，吸收光谱的特征值包括：吸收光谱形状，吸收峰（谷）的数目，各吸收峰（谷）所在的波长、强度和对应的吸光系数等。二、定性分析吸光度波长λ/nmAB不同物质的吸收光谱图将待测试样与标准品配成浓度相同或相近的溶液。在相同条件下分别测定试样与标准品的吸收光谱。然后比对两吸收曲线是否一致。1232.定性分析分法（1）比吸收光谱曲线的一致性吸光度300400500600700波长/nm样品样品的吸收光谱图吸光度300400500600700波长/nm标准品维生素B2标准品的吸收光谱图【示例】维生素B2的鉴别将测得的样品λmax、λmin和值与文献收载的规定值比较即可鉴别。（2）对比吸收光谱特征值的一致性主要特征值包括：最大吸收波长、最小吸收波长、最大吸收波长处的吸光系数等。对比吸收光谱特征值时，须同时比对多个特征值是否一致。M=298.43λmax=240±1nm=571M=386.53λmax=240±1nm=408因此，对比吸收光谱特征数据时，必须同时比对最大吸收波长和最大吸收波长处的吸光系数是否一致。黄体酮炔诺酮λmax相同，但

不同●不同的物质可能具有相同的λmax，但因分子量不同，则其λmax处的吸光系数必定不同，如黄体酮和炔诺酮的鉴别。●不同的物质可能具有相同的光谱特征数据，但因结构不同，吸收曲线必定不一样。吸光度B220260300340波长λ（nm）醋酸可的松λmax=240nm，

λmax=240nm，

220260300340波长λ（nm）吸光度醋酸氢化可的松两者的光谱特征数据几乎完全相同，但吸收光谱曲线形状存在明显差异。

如维生素B12的鉴别《中国药典》（2015年版）规定：维生素B12的λmax=278nm、361nm和550nm，且A361/A278=1.70～1.88；A361/A550=3.15～3.45。278.22nm361.72nm550.33nm维生素B12光谱图

吸光度300400500600波长（nm）对于有多个吸收峰的化合物，比较各吸收峰处对应的吸光度（或吸光系数）比值可用于鉴别。（3）对比吸度比值的一致性吸光度300400波长λ/nm药品甲氧苄啶吸收光谱如：药品甲氧苄啶的纯度检查药品与杂质只要存在紫外吸收的差异，药品中存在的杂质会使药品的吸收曲线变形，即可进行纯度或杂质检查。3.纯度与杂质检查吸光度300400波长λ/nm甲氧苄啶标准品吸收光谱■若药品与杂质的吸收峰位不重叠，则药品中的杂质会使药品的吸收曲线变形。如苯中杂质苯酚的检查：

苯在256nm处有强吸收，而苯酚在此处无吸收，却在328nm处有强吸收。故从光谱曲线中可以看出苯中是否存在杂质苯酚。样品与标准品的吸收光谱曲线吸光度样品苯的吸收光谱苯标准品吸收光谱300400波长λ/nm（1）杂质判断■若药品与杂质的吸收峰位重叠，杂质的存在会使吸收峰处的吸光系数改变。峰位处的吸光系数值变小图1.杂质吸收强于化合物吸光系数300400波长λ/nm样品图谱标准品图谱图2.杂质吸收弱于化合物300400波长λ/nm吸光系数样品图谱标准品图谱峰位处的吸光系数值变大

《中国药典》（2015年版）规定：取每1ml含2mg的供试品溶液，于1cm吸收池在310nm处测定吸光度不得超过0.05。如：肾上腺素中杂质肾上腺酮的检查吸光度300400波长λ/nm肾上腺素肾上腺素酮肾上腺素与肾上腺素酮的吸收光谱

特征：310nm处杂质肾上腺酮有最大吸收，而药物肾上腺素几乎没有吸收。（2）杂质限量检查葡萄糖注射液是临床上常用的药品之一。制备时需要高温灭菌，葡萄糖会转化为5-羟甲基糠醛而引入杂质。《中国药典》（2015年版）规定葡萄糖注射液在284nm波长处的吸收度不得过0.32，以此控制其杂质5-羟甲基糠醛的量。

【解释】在284nm波长处葡萄糖无吸收，而杂质5-羟甲基糠醛在此波长处有最大吸收，可以通过控制供试品溶液在此波长处的吸收度来控制杂质的含量。葡萄糖注射液中杂质的检查案例分析1.定量分析的理论依据三、定量分析●理论依据：朗伯-比尔定律A=K•c•L实际测定时保持溶液的厚度L不变，则待测溶液的吸光度A与浓度C呈正比例关系，即：A=K•c吸光度A浓度cA-c关系曲线2.单组分溶液的定量分析方法（1）单组分定量分析的条件：

只测定试样中的一种成分，且在测量波长下试样中其他组分对被测组分不干扰。（2）单组分样品定量分析的方法A.标准曲线法标准曲线法是最经典的定量方法，方法是:配制一系列不同浓度的标准溶液，相同条件下在待测组分的最大吸收波长处分别测定各标准溶液的吸光度，绘制标准曲线，求出回归方程。然后将在相同条件下测得的待测溶液的吸光度值代入回归方程即可求出待测组分的含量。系列标准溶液标准溶液的浓度C0(空白)01C1

2C2

3C3

4C4

5C5

编号①以待测组分的纯品配制系列浓度的标准溶液（包括不含被测组分的空白试液）。标准曲线法方法与步骤标准溶液的浓度标准溶液吸光度C0(空白)A0(空白)C1A1