酶工程绪论学习课件

第一章绪论主要内容第一节酶的基本概念与发展历史第二节酶催化作用的特点第三节影响酶催化作用的因素第四节酶的分类与命名第五节酶的活力测定第六节酶的生产方法第七节酶工程发展概况生物技术的四大支柱基因工程：用“剪刀+糨糊”创造新物种的工程。细胞工程：微观水平的嫁接技术。酶工程：让工厂高效、安静、美丽如画的工程。发酵工程：把微生物或细胞造就成无数微型工厂，将神话变为现实的桥梁。酶工程概述酶的概念：酶是具有生物催化功能的生物大分子。酶的分类：蛋白类酶（proteozyme,protein

enzyme,P酶）核酸类酶（robozyme,RNA

enzyme,R酶）酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程。酶工程的主要任务：经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶的特性得以改进，充分发挥其催化功能。第一节酶的基本概念与发展历史人们对酶的认识起源于生产与生活实践：夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。公元前12世纪周朝，人们就会制作饴糖和酱。春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。酶者，酒母也第一节酶的基本概念与发展历史酶的存在及作用的认识：1833年：发现淀粉酶19世纪中叶：糖发酵产酒与活酵母有关1878年：给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个字来自希腊文，其意思是“在酵母中”。1897年，德国巴克纳Buchner兄弟发现不含细胞的酵母提取液也能使糖发酵，说明发酵与细胞的活动无关，从而说明了发酵是酶作用的化学本质，为此Buchner获得了1907年诺贝尔化学奖。第一节酶的基本概念与发展历史对酶的作用机理及酶的本质的深入研究：1902年，提出酶催化过程的中间产物学说1913年，根据中间产物学说推导出酶促反应的的基本动力学方程——米氏方程。1930年，证实酶是一种蛋白质；80年代初发现了具有催化功能的RNA——核酶(ribozyme)，这一发现打破了酶是蛋白质的传统观念，开辟了酶学研究的新领域1989年，因核酶的发现，切克和阿尔特曼共同获得1989年度诺贝尔化学奖。现已鉴定出4000多种酶，数百种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。第二节酶催化作用的特点一、酶催化作用的专一性强专一性：指在一定的条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物，进行某种类型反应的特性。专一性绝对专一性相对专一性基团专一性键的专一性1、绝对专一性绝对专一性概念：一种酶只能催化一种底物进行一种反应。包括立体异构专一性。如：蔗糖酶、麦芽糖酶。立体异构专一性：当作用的底物含有不对称碳原子时，酶只能作用于异构体的一种。如：乳酸脱氢酶。核酸类酶也具有绝对专一性。1、绝对专一性2、相对专一性相对专一性概念：一种酶能够催化一类结构相似物质进行某种相同类型的反应。（1）基团专一性要求底物含有某一相同的基团。如：胰蛋白酶，是肽链内切酶，能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。（2）键专一性要求底物具有相同化学键。如：酯酶，可催化含酯键的酯类物质水解生成醇和酸。思考：酶为什么具有催化专一性？二、酶催化作用的效率高与非酶促反应相比：是其107~1013倍。非酶促：100℃，3×10－10/s在脲酶作用下：20.8℃，3×104/s与其它催化剂相比此反应在过氧化氢酶的作用下，比在Fe2＋的作用下，反应速度常数将近快9个数量级。思考：酶的催化为什么具有高效性？三、酶催化作用的条件温和酶催化反应的一般条件：常温，常压，近中性的pH值环境。一般非酶催化反应条件：高温、高压和pH极端原因：酶促反应所需活化能低酶是具有生物催化功能的生物大分子。第三节影响酶催化作用的因素一、底物浓度的影响底物浓度与酶催化反应速度之间的关系：第三节影响酶催化作用的因素二、酶浓度的影响酶催化反应速度与酶浓度成正比。三、温度的影响在某一特定的温度条件下，酶催化速度达到最大，超过最适温度，反应速度逐步降低。四、pH的影响每一种酶都有其各自最适pH范围和最适pH。五、抑制剂的影响第三节影响酶催化作用的因素五、抑制剂的影响可逆抑制剂不可逆抑制剂竞争性抑制剂非竞争性抑制剂反竞争性抑制剂六、激活剂的影响激活剂：金属离子、无机负离子、蛋白酶等。第四节酶的分类与命名按照分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为蛋白类酶（P酶）和核酸类酶（R酶）。命名总原则：根据酶作用的底物和催化反应的类型进行分类和命名。两类酶的命名差别：蛋白类酶只能催化其他分子进行反应，而核酸类酶既可以催化酶分子本身也可以催化其他分子进行反应。第四节酶的分类与命名蛋白类酶的种类：氧化还原酶类 Oxidoreductases转移酶类 Transgerases水解酶类 Hydrolases裂合酶类 Lyases异构酶类 Isomerases合成酶类 Synthetases

或连接酶ligases注意：顺序不要搞错！第四节酶的分类与命名核酸类酶的种类：分子内催化R酶：自我剪切酶自我剪接酶分子间催化R酶：RNA剪切酶DNA剪切酶多肽剪切酶多糖剪接酶氨基酸酯剪切酶多功能酶一、蛋白类酶（P酶）的分类与命名酶的命名有两种方法：系统名、推荐名（惯用名）。推荐名推荐名通式：底物的名称＋催化反应的类型＋“酶”字说明：1、对于水解酶类，在命名时可省去说明反应类型的“水解”字样。如：淀粉酶（省略“水解”二字）。2、底物只取一个较重要的底物名称。如：葡萄糖氧化酶（省略底物“氧”）。一、蛋白类酶（P酶）的分类与命名系统名通式：酶作用底物＋酶作用基团＋催化反应类型＋“酶”字举例β－D－葡萄糖:氧1－氧化还原酶酶的命名有两种方法：系统名、惯用名。系统名：包括所有底物的名称和反应类型。乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸：NAD+氧化还原酶惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。乳酸：NAD+氧化还原酶乳酸脱氢酶对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。一、蛋白类酶（P酶）的分类与命名蛋白类酶（P酶）的分类原则如下：（1）按照酶催化作用的类型，将蛋白类酶分为六大类。（2）每个大类中，按照酶作用的底物、化学键或基团的不同，分为若干亚类。（3）每一亚类再分为若干小类。（4）每一个小类中包括若干个具体的酶。一、蛋白类酶（P酶）的分类与命名系统编号：四码编号方法，根据分类原则进行，格式：E.C.X.X.X.X如：乳酸脱氢酶EC1.1.1.27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。(1)氧化还原酶Oxidoreductase转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。

例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。(2)转移酶Transferase水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：(3)水解酶hydrolase裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反应。(4)裂合酶Lyase异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。

例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。(5)异构酶Isomerase合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H===AB+ADP+Pi

例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2草酰乙酸(6)合成酶LigaseorSynthetase核酸类酶（R酶）的分类自1982年以来，被发现的核酸类酶越来越多，对它的研究越来越广泛和深入。但是对于分类和命名还没有统一的原则和规定。根据酶催化反应的类型，可以将R酶分为剪切酶，剪接酶，和多功能酶等三类。根据R酶的结构特点不同，可分为锤头型R酶，发夹型R酶，含I型IVS的R酶，含II型IVS的R酶等。根据酶催化的底物是其本身RNA分子还是其它分子，可以将R酶分为分子内催化（incis，也称为自我催化）和分子间催化（intrans）两类。第五节酶的活力测定测定酶的活力，往往是为了确定酶量的多少及其变化情况。酶活力：是指在一定条件下，酶所催化的反应速度。酶催化反应速度通常用单位时间（t）内底物（S）的减少量或产物（P）的增加量表示。即：

dSdPu=-----=-----

dtdt一、酶活力测定方法一、酶活力测定的两个阶段①在一定条件下，酶与某作用底物反应一段时间；②用各种方法检测反应液中底物或产物的变化量。酶活力测定的一般步骤A：根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配成一定浓度的底物溶液。B：确定反应的温度、pH值等条件。C：在一定条件下，将酶液与底物混匀，选择适宜的反应时间，使底物转化率≥10％，保证为初速度反应。D：终止反应E：采用光学检测法、化学检测法等生化监测技术，测定反应液中物质的变化量。终止酶反应的常用方法沸水浴加入酶变性剂：如三氯乙酸等加入酸或碱溶液迅速降温测定反应液中底物的减少量或产物的生成量的方法技术化学检测法：如用化学滴定法测定糖化酶水解淀粉生成的葡萄糖的量。分光光度法：如用分光光度计测定碱性磷酸酶水解硝基酚磷酸生成的对硝基酚的量。气体检测法：如用华勃士呼吸仪测定二氧化碳的生成量等。一种酶可以有多种测定方法，要根据实际情况选用。二、酶活力单位酶活力的高低，是以酶活力的单位数来表示的。1961年国际生化学会（IUB）酶学委员会建议使用统一的国际单位。酶活力的国际单位定义：在实验室规定的条件下，每1min催化lumol底物转化为产物所需要的酶量为一个酶活力国际单位(用“IU”表示，简写为U)。1.从习惯单位换算成国际单位比较麻烦。2.很多底物分子量不明（如淀粉酶），难以执行。3.各国的测定温度不同，结果也不尽相同。因此，目前国内外仍多用习惯单位。二、酶活力单位国际上另一个常用的酶活力单位是卡特（kat）。在特定条件下，每秒催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（kat）。两种酶活力单位之间可以互相换算，即：1cat=1mol/s=60mol/min=60×106μmol/min=6×107IU二、酶活力单位为了比较酶制剂的纯度和活力的高低，常使用比活力这个概念。酶的比活力：是酶纯度的一个指标，是指在特定的条件下，单位质量（mg）蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。酶比活力=酶活力（单位）/mg（蛋白质或RNA）三、酶的转换数与催化周期酶的转换数Kcat，又称摩尔催化活性，是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。即每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数，是酶催化效率的一个指标。转换数的倒数称为酶的催化周期。催化周期是指酶进行一次催化所需的时间。四、固定化酶的活力测定固定化酶：与水不溶性载体结合、在一定的空间范围内起催化作用的酶称为固定化酶。四、固定化酶的活力测定1、振荡测定法在特定条件下，一边振荡或搅拌，一边进行催化反应。注意：振荡或搅拌的方式和速度对反应速度有影响。底物浓度、pH、反应温度、激活剂浓度、抑制剂浓度、反应时间等测定条件最好在固定化酶应用的工艺条件下进行活力测定。四、固定化酶的活力测定2、酶柱测定法将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中，让条件适宜的底物溶液，以一定的速率流过酶柱，收集流出的反应液。注意：反应液经酶柱的流速对反应速度有很大影响；此外，酶柱的形状、径高比对反应速度也有明显影响。底物浓度、pH、反应温度、激活剂浓度、抑制剂浓度、反应时间等测定条件最好在固定化酶应用的工艺条件下进行活力测定。四、固定化酶的活力测定3、连续测定法测定时，将振荡反应器中的反应液用泵连续引到连续测定仪的流动比色杯中进行连续分光测定。优点：准确了解某一时刻的酶活力变化情况。对利用固定化酶进行连续生产和自动控制有重大意义。四、固定化酶的活力测定4、固定化酶的比活力测定每克（g）干固定化酶所具有的酶活力单位数。方法1：称取干固定化酶，充分溶胀后→测比活力。方法2：对湿固定化酶测出酶活力之后→干燥→称重→测比活力酶膜、酶管、酶板等：用单位面积的酶活力单位表示，即：比活力=酶活力单位/cm2四、固定化酶的活力测定5、酶结合效率与酶活力回收率的测定酶结合效率（固定化率）：一般由加入的总酶活力减去未结合的酶活力的产值与加入的总酶活力的百分比来表示。酶活力回收率：指固定化酶的总活力与用于固定化的酶总活力的百分比。酶结合效率＝加入的总酶活力－未结合酶活力加入的总酶活力×100％酶回收率＝固定化酶的总活力用于固定化的酶总活力×100％四、固定化酶的活力测定6、相对酶活力：具有相同酶蛋白（或酶RNA）量的固定化酶活力和游离酶活力的比值称为相对酶活力。相对酶活力与载体结构、固定化酶颗粒大小、底物相对分子质量的大小以及酶结合效率等有密切关系。相对酶活力的高低，表明了固定化酶应用价值的大小。第六节酶的生产方法酶的生产：是指通过人工操作而获得所需酶的技术过程。酶的生产方法可以分为：提取分离法生物合成法化学合成法一、提取分离法提取分离法：是采用各种提取、分离、纯化技术从动物、植物的组织、器官、细胞或微生物细胞中将酶分离提取出来，再进行分离纯化的技术过程。酶的提取：是指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。主要的提取方法有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。酶的分离纯化：采用各种生化分离技术，使酶与各种杂质分离，达到所需的纯度，以满足使用的要求。一、提取分离法优点：设备较简单，操作较方便。不足：生物资源获取较难是酶学研究必不可缺的重要手段。二、生物合成法生物合成法：利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的生命活动而获得人们所需酶的技术过程。包括：微生物发酵产酶——即发酵法植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶二、生物合成法优点：生产周期较短，酶的产率较高，不受生物资源、地理环境和气候条件等的影响的显著特点。不足：对发酵设备和工艺条件的要求较高，在生产过程中必须进行严格的控制。三、化学合成法1965年，我国人工合成胰岛素，开辟了蛋白质化学合成的新纪元。1969年。美国首次用化学合成法得到含124个氨基酸的核糖核酸酶。目前，可用肽合成仪进行酶的化学合成。第七节酶工程发展概况酶工程的概念：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。酶的生产：微生物发酵产酶、动植物培养产酶、酶的提取和分离纯化酶的改性：酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化和酶的定向进化酶的应用：通过酶的催化作用获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。酶工程的内容微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子的修饰，酶、细胞