酶类-r谷氨酰转肽酶

病理检验技术

特殊染色

酶类ϒ-谷氨酰转肽酶

酶类

ϒ-谷氨酰转肽酶

ϒ-谷氨酰转肽酶(ϒ-glutamyltranspeptidase)又称谷胱甘肽酶,此酶能从还原型谷胱甘肽分解ϒ-谷氨酰基,并使其与氨基酸或肽结合,从而合成新的ϒ-谷氨酰肽。在生理状态下,还原型谷胱甘肽是γ-谷氨酰转肽酶的底物,现已能人工合成多种萘酰胺行生物作为底物，如γ-L-谷氨酰-α-萘酰胺、γ-L-谷氨酰-萘酰胺和γ-谷氨酰-4-甲氧基-β-萘酰胺等,这些底物均可在γ-谷氨酰转肽酶作用下生成萘酰胺,后者与重氮盐或六偶氮对品红形成较稳定的偶氮染料。ϒ-谷氨酰转肽酶

γ-谷氨酰转肽酶为细胞的一种膜结合酶,与组织内的氨基酸和肽的调节、分泌、吸收、转运和合成有关,硫酸铜可抑制此酶活性。γ-谷氨酰转肽酶见于肾曲小管上皮、胰腺细胞、肝胆管上皮、睾丸曲细精管上皮以及小肠上皮的纹状缘等。ϒ-谷氨酰转肽酶

萘酰胺法(根据Londa)(一)试剂配制1.1mol/L氢氧化钠2.底物溶液:γ-L谷氨酰-α-萘酰胺2mg、二甲基甲酰胺0.15ml、lmol/L氢氧化钠0.15ml、蒸馏水4.7ml，依次加入,充分溶解混合,置于4℃的冰箱内可保存1周3.2mol/L盐酸4.4%的对品红盐酸液：对品红1g、2mol/L盐酸25ml、充分溶解后于第2天过滤,置于4℃的冰箱约可保存使用1年5.4%的亚硝酸钠(sodiumnitrite)即配即用,不能保存。ϒ-谷氨酰转肽酶（萘酰胺法(根据Londa)

）6.0.1mol/l醋酸盐缓冲液(pH6.5)7.缓冲六偶氮对品红液：4%的对品红盐酸液0.25ml、4%的亚硝酸钠液0.25ml、0.1mol/L醋酸盐缓冲液(pH6.5)8.5ml取洁净烧杯一只,先滴入对品红盐酸液,然后慢慢滴入4%亚硝酸钠液,边滴边充分摇匀,混合后放置2分钟,使充分偶氮化,最后加入0.1mol/L醋酸盐缓冲液(pH6.5),混合后用1mol/L氢氧化钠调至pH6.5。8.孵育液：底物溶液1ml、缓冲六偶氮对品红液9ml、甘氨酰替甘氨酸5mg9.2%的硫酸铜10.Mayer苏木精液(见“萘酚AS-TR磷酸酯法”)ϒ-谷氨酰转肽酶（萘酰胺法(根据Londa)

）(二)染色步骤1.新鲜组织低温恒冷切片(用液氮快速冷冻效果更佳),厚6μm,贴于玻片,取出风扇吹干30分钟后入冷丙酮固定10分钟。2.切片浸入孵育液于室温(20~25℃)孵育15~45分钟。3.蒸馏水洗。4.2%的硫酸铜处理5分钟。5.蒸馏水洗。6.10%的甲醛液固定1小时。7.流水冲洗5分钟。8.Mayer苏木精液浅染胞核2~3分钟。9.流水冲洗10分钟。10.常规脱水透明,中性树胶封固。ϒ-谷氨酰转肽酶（萘酰胺法(根据Londa)

）(三)结果酶活性部位呈棕色至棕黄色,胞核呈蓝色。(四)对照方法1.配孵育液时,用等量蒸馏水代替底物溶液,结果为阴性。2.在孵育液内加入0.001mol/L的硫酸铜,结果为阴性。肾组织，ϒ-谷氨酰转肽酶活性部位呈棕黄色图萘酰胺法ϒ-谷氨酰转肽酶（萘酰胺法(根据Londa)

）(五)注意事项1.甘氨酰替甘氨酸作为激活剂,有增强酶反应的强度,尤其适合于酶活性低的组织。2.底物γ--L谷氨酰-a-萘酰胺可用γ-L-谷氨酰-β-萘酰胺代替,但以前者更易溶解,水解也较快,定位好。3.本法以采用醋酸盐缓冲液为佳,如用其他缓冲液,可使酶活性减弱。4.谷氨酰转肽酶最适pH约为8.8,但因本法使用六偶氮对品红作偶联剂。使用六偶氮对品红作偶联,其pH不宜高于6.5,否则六偶氮对品红液容易发生降解而失效。ϒ-谷氨酰转肽酶（萘酰胺法(根据Londa)

）(六)染色机制γ-L-谷氨酰-a-萘酰胺在γ-谷氨酰转肽酶的催化下生成γ-L谷氨酰-γ-L-谷氨酰-α--萘酰胺和a-萘胺,后者与六偶氮对品红偶联形成一种稳定的偶氮染料,该偶氮染料再与铜离子整合形成棕黄色的复合物在酶活性部位显色。甘氨酰替甘氨酸的作用是提高γ-谷氨酰转肽酶的活性。ϒ-谷氨酰转肽酶（萘酰胺法(根据Londa)

）(七)应用在胎儿和刚出生的新生儿,其肝细胞中的γ