标准方法验证作业指导书

标准方法验证作业指导书一、 目的在实验室引入标准方法时，实验室应验证操作方法是否满足标准的要求，即证实该方法能在该实验室现有的设施设备、人员、环境条件下获得令人满意的结果。二、 适用范围适用于实验室对微生物检测方法进行方法验证，也适用于实验室对引入标准方法正式使用前的方法验证。三、 职责3.1技术负责人指定专人负责方法的确认，并对方法确认的结果进行核查批准；3.2参加方法确认的工程师应详细记录试验现象及数据，总结实验结果，并编写成文件；3.3相关人员严格按此作业指导书作业书。四、 名词解释4.1方法验证实验室通过核查或试验，提供客观证据证明满足检测方法的要求，即提供客观证据以证明实验室能够正确运用该方法，确保实现所需的方法性能。注：适用时，应考虑测量不确定度。4.2定性方法用直接或间接的方法检测目标微生物是否存在的分析方法。4.3定量方法对一定数量的样品进行直接（如：对一定质量或体积样品进行计数）或间接（如：吸光值、阻抗等）测量目标微生物数量的分析方法。4.4检出水平微生物定性检测方法，通过给定的检测步骤，获得阳性检测结果的概率为x的测量分析物的含量。示例：LOD50%测量给出阳性结果的检出水平。504.5估计LOD50基于实验设计方案测定LOD5o（阳性结果检测概率为50%）。注：由于测试样品的数量非常少，因此无法准确测定lod5o,因此，使用术语估计lod5o。五、验证内容 50 505.1特性参数的选择实验室进行方法验证的内容包括但不限于以下方法特性：a） 检出水平；b） 估计偏差；c） 精密度；d） 测量不确定度。方法验证应根据方法的预期用途，选择需验证的方法特性参数，典型需要验证的方法特性参数见下表A。表A方法验证参数的选择待评估性能参数定量方法定性方法检出水平—V估计偏差V—精密度V—测量不确定度V—注：”表示正常情况下需要验证的性能参数；一表示正常情况下不需要验证的性能参数。5.2定性方法每种基质至少需要在高、中、低3个不同接种水平和无接种情况下完成测试，每种情况下测试两次，共得到8个测试结果，包括2各高水平；接种量是不超过预期LOD50的十倍；2个中水平；将高水平接种物稀释2倍得到中间水平接种物；2个低水平；将高水平接种物稀释10倍得到低水平接种物；2个无接种物，作为空白对照。高水平的接种（10xlod50）只能获得阳性结果，如果获得阴性结果，则对应所有水平进行重复实验，空白对照不应获得阳性结果，则应对所有水平进行重复实验。记录每个接种水平获得的阳性结果的数量，并使用下表B确定估计的LOD50，并与方法确认研究中的LOD5°进行比较，如果没有该方法的确认资料，则估计的LOD50应该W3CFU/测试单元。表B根据每个污染水平的阳性结果数量估计LOD50高水平的接种（约10XLOD50/测试单元）中间水平的接种（约5XLOD50/测试单元）低水平的接种（约1XLOD50/测试单元）空白对照估计LOD50（CFU/测试单元）2/22/22/20/2V1XLOD 50 2/22/21/20/2=1XLOD 50 2/22/20/20/2=2XLOD 50 2/21/22/20/2=2XLOD 50 2/21/21/20/2=3XLOD 50 2/21/20/20/2=4XLOD 50 2/20/22/20/2不可靠的结果2/20/21/20/2=5XLOD 50 2/20/20/20/2=8XLOD sn 注：结果的组合不太可能在测试污染水平时发生，因此导致不可靠的结果，因此该测试应重复进行。5.3定量方法5.3.1估计偏差选定用于方法验证的基质种类，定量方法的验证试验尽可能使用自然污染的样品。样品可以来自不同的批次（不同的产品，不同的生产商等），以覆盖方法的测定范围。每个验证的基质种类需要测定3个不同批次，每个批次代表1个污染水平，3个污染水平应涵盖该方法的使用范围。根据污染水平以及目标微生物种类，如果样品测试单元的预期自然污染水平低于某限值，则建议使用人工污染的方式。实验室使用参考方法（首选）或实验室当前使用的方法，作为对照方法与待验证方法同步进行试验。如果实验室没有可同步进行的对照方法，实验室应采用非选择性培养基计数培养物的浓度。每个污染水平，待验证方法的计数结果与对照方法结果之间的差值在0.5lgCFU/g以内。5.3.2精密度定量分析的精密度仅表现为实验室内重复性。对于在重复性条件下进行的适当的测量数据，可用实验室内重复性标准偏差（Sr）表示。测量样品尽可能使用自然污染的物品，如果样品测试单元的预期自然污染水平低于10CFU/g，则使用人工污染的方式。重复性的测定通常需要测定10个以上的测试样品。将每个测试样品均质化并从该均质样品中取出两个测试单元，定义为测试单元A和测试单元B。在验证方法规定的范围内，测试单元A和测试单元B的测试条件应尽量不同，应包括但不限于：a） 技术人员；b） 培养基和试剂；c） 仪器（培养箱、涡漩混合器、移液器等）。实验室内重复性标准偏差（Sr）应小于或等于该方法在确认研究中给出的实