桑叶多酚氧化酶

第一章桑叶多酚氧化酶的研究意义1.1桑叶及多酚氧化酶的简介1.1.1桑叶的简介桑叶是桑科植物桑的干燥叶，又名家桑、荆桑、桑椹树、黄桑等，全国大部分地区多有生产，具有降血压、血脂、抗炎等作用。由中国少数民族苗族所传秘方，原料来源于云贵高原无污染地带的稀有植物，是一款具有较强抗氧化功效的袋茶饮。富含稀有元素有机硒、锗，是天然的强抗氧化剂，可清除体内自由基，使蓄积在人体内的毒素和废物被氧化，增加血液中的含氧量，促进新陈代谢和微循环。对于高血脂、高血糖、脂肪肝、冠心病、高血压，甲、乙型肝炎的治疗以及癌症术后放化疗病人的康复有非常好的辅助作用。栽培或野生。全国大部分地区多有生产，尤以长江中下游及四川盆地桑区为多。原植物喜温暖湿润气候，稍耐荫，耐旱，不耐涝，耐贫瘠，对土壤适应性强。味苦、甘，性寒。归肺、肝经。功效疏散风热、清肺润燥、清肝明目。临床上习惯认为经霜者质佳，称“霜桑叶”或“冬桑叶”，饮片名称桑叶、蜜炙桑叶。提高桑叶产量，是发展蚕桑丝绸事业的基础，而经营好桑园又是桑叶丰产的根本。中国的农学家们在桑树良种的选育、桑树用肥、桑树病虫害的防治和桑园管理等方面，不断地深入研究并取得了丰硕的成果，现经收集整理和新育成的桑品种已有千余个。如浙江和江苏有湖桑和火桑两个桑品种群。湖桑一般枝条粗长，叶形大，硬化迟，适应性强，多数属中生和晚生品种。火桑有红皮火桑和白皮火桑，其新梢嫩叶呈紫红色，均属早生品种。四川有川南乐山嘉定桑，枝条长，叶稀叶质好；川东北的冠桑枝条细直，皮色青灰。山东有鲁桑，枝条粗短、节密、硬化早、耐寒。而对桑叶的保鲜，对发展蚕桑丝绸事业也有重大的意义。如何防止桑叶的褐变现象发生，对桑叶多酚氧化酶的研究则是必不可少的项目。1.1.2多酚氧化酶的简介多酚氧化酶是一种蛋白体，在茶树生命活动和茶叶加工过程中参与一系列由酶促活动而引起的化学变化，故又被称为生物催化剂。多酚氧化酶（PolyphenolOxidase,PPO;氧化还原酶）是一种金属蛋白酶，能催化邻-苯二酚氧化成邻-苯二醌，也能作用于单酚单加氧酶的底物。其普遍存在植物、真菌、昆虫的质体中，在自然界中分布及其广泛。由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。它主要由铜离子辅基和主酶两部分组成，铜离子辅基不可透析。茶叶中的酶较为复杂，种类很多，包括氧化还原酶、水解酶、裂解酶、磷酸化酶、移换酶和同工异构酶等几大类。酶蛋白具有一般蛋白质的特性，在高温或低温条件下有易变性失活的特点。各类酶均有其活性的最适温度范围，一般在30°C〜50°C范围内酶活性最强。酶若失活、变性，则就丧失了催化能力。酶的催化作用具有专一性，如多酚氧化酶，只能使茶多酚物质氧化，聚合成茶多酚的氧化产物茶黄素、茶红素和茶褐素等；蛋白酶只能促使蛋白质分解为氨基酸。多酚氧化酶(polyphenoloxidase,PPO)是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年KeilinD.和Mann6.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为 polyphenoloxidase。多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，邻苯二酚氧化还原酶，是六大类酶中的第一大类氧化还原酶XL多酚氧化酶是一种蛋白体，在茶树生命活动和茶叶加工过程中参与一系列由酶促活动而引起的化学变化，故又被称为生物催化剂。茶叶中的酶较为复杂，种类很多，包括氧化还原酶、水解酶、裂解酶、磷酸化酶、移换酶和同工异构酶等几大类。酶蛋白具有一般蛋白质的特性，在高温或低温条件下有易变性失活的特点。各类酶均有其活性的最适温度范围，一般在30C〜50C范围内酶活性最强。酶若失活、变性，则就丧失了催化能力。酶的催化作用具有专一性，如多酚氧化酶，只能使茶多酚物质氧化，聚合成茶多酚的氧化产物茶黄素、茶红素和茶褐素等；蛋白酶只能促使蛋白质分解为氨基酸[I。*。茶叶加工就是利用酶具有的这种特性，用技术手段钝化或激发酶的活性，使其沿着茶类所需的要求发生酶促反应而获得各类茶特有的色香味。如绿茶加工过程中的杀青就是利用高温钝化酶的活性，在短时间内制止由酶引起的一系列化学变化，形成绿叶绿汤的品质特点。红茶加工过程中的发酵就是激化酶的活性，促使茶多酚物质在多酚氧化酶的催化下发生氧化聚合反应，生成茶黄素、茶红素等氧化产物，形成红茶红叶红汤的品质特点。多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶（酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1）、双酚氧化酶（儿茶酚氧化酶catecholoxidse,EC.1.10.3.2）和漆酶（laccase,EC.1.10.3.1）。在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。现在大部分文献所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。在植物（如苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆类、茶叶、桑叶、烟草等组织中，PPO是与内囊体膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后PPO被活化，从而表现出活性。在果蔬细胞组织中，PPO存在的位置因原料的种类、品种及成熟度的不同而有差异，绿叶中PPO活性大部分存在于叶绿体内；马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有PPO,含量大约与蛋白质部分相同；在茶叶中的PPO分为游离态和束缚态，前者主要存在于细胞液中属可溶态PPO,而后者则主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态，ThanarajS.N.（1990）研究了茶树新梢中PPO活性及多酚含量对红茶品质的影响，发现PPO活性强，多酚含量高，对红茶品质有利，相反则利于绿茶的生产；新鲜的苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在于叶绿体和线粒体中。从这两部分分别制备的PPO,其底物专一性稍有差异。刘乾刚认为，PPO在细胞内除了存在于叶绿体及线粒体上外，细胞壁也可能存在PPO,且对发酵产生影响，细胞只要轻微破损便有PPO的作用。多酚氧化酶是一种质体酶，有些研究人员认为多酚氧化酶可能仅存在于质体中，缺乏质体的组织就不存在多酚氧化酶，例如筛管和筛胞等，但是有质体的组织也可能没有多酚氧化酶，如C4植物叶。含有质体的植物组织不一定都存在多酚氧化酶，而多酚氧化酶一定在含有质体的植物组织中。随分子生物学的发展，象西红柿、苹果等的多酚氧化酶的基因已被克隆。浙江大学赵东等对茶树多酚氧化酶的克隆及其序列进行了比较。从已经克隆的多酚氧化酶的基因看，均属于基因家族，多则6-7个基因。这些基因的表达具有时空差异和组织特异性（PPO在幼龄组织中表达，在成熟组织中不表达），表明多酚氧化酶的基因在植物中所起的作用不同。高等植物组织发生褐变主要是PPO作用的结果，PPO催化多酚氧化为醌，醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应，结果产生黑色素沉淀[17-1。9]常用检压法和分光光度法。前者应用多酚氧化酶（PPO）可催化儿茶素等底物在有氧条件下的氧化还原反应，根据底物的氧化速率与单位酶浓度和单位时间内的耗氧量成正比这一原理，用瓦氏呼吸仪测定反应过程中的耗氧量求得PPO活性的大小，此方法设备简便，但操作复杂，误差较大。后者利用邻苯二酚和D-儿茶素在PPO催化下生成有色产物.其显色物质在460纳米处有最大吸收，吸收值在单位时间内的变化和单位酶活性成正比，计算PPO活性强度。操作方法简便，重现性好。与检压法原理相似的方法有氧电极法，应用也较多。1.2桑叶多酚氧化酶的研究意义饲料在加工过程中或长期贮存于湿热环境下，其所含的氨基化合物如蛋白质、氨基酸及醛、酮等与还原糖相遇，经过一系列反应生成褐色聚合物的现象称为褐变反应，简称褐变。酶促褐变多发生在水果蔬菜等新鲜植物性食物中，是酚酶催化酚类物质形成醌及其聚合物的结果。植物组织中含有酚类物质，在完整的细胞中作为呼吸传递物质，在正常的情况下，氧化还原反应之间（酚和醌的互变）保持着动态平衡，当组织破坏后氧就大量侵入，打破了氧化还原反应的平衡，于是发生了氧化产物醌的积累和进一步聚合及氧化，形成黑色。催化酶促褐变的酶有酚酶、抗坏血酸脱氢酶、过氧化物酶等。酚酶是以氧为受氢体的末端氧化酶，是两种酶的复合体，其一是甲酚酶（又称酚羟化酶），作用于一元酚，另一是儿茶酚酶（又称为多元酚氧化酶），作用于二元酚。也有人认为酚酶是既能作用一元酚，又能作用于二元酚的一种特异性不强的酶。ppo与抗病性的关系人们已进行了广泛的研究。植物在抵御病原微生物的侵染过程中，抗性相关酶发挥了重要作用，这主要包括了酚类代谢系统中的一些酶和病原相关蛋白家族PPO通过催化木质素及醌类化合物形成，构成保护性屏蔽而使细胞免受病菌的侵害，也可以通过形成醌类物质直接发挥抗病作用。目前已比较成功的有:黄瓜对黑星病的抗性，苹果对轮纹病的抗性，香蕉对束顶病的抗性，柠檬对流胶病的抗性，甘薯对蔓割病的抗性，水稻对白叶枯病的抗性等等[20-23]茶叶中所有化学成分中，儿茶素与多酚氧化酶尤为重要，除绿茶、黄茶外，各种茶叶的加工都是基于儿茶素在多酚氧化酶催化下的氧化作用，即所谓的“发酵”过程。有的学者在红碎茶加工中，利用茶幼果作为外源PPO的载体，以一定比例用于红碎茶加工过程，结果发现能明显提高成茶的TF含量，减少TB含量。还有的学者进行了内源酶发酵研究，以期望能在茶饮料中有所应用，改善滋味。多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐变的主要酶类，PPO催化果蔬原料中的内源性多酚物质氧化生成黑色素，严重影响制品的营养，风味及外观品质。这些情况对生产者与消费者均是不希望看到的，仅在少数几种食品的生产中，人们利用了PPO的作用，如茶叶、咖啡、黑葡萄中的多酚氧化酶。对PPO的酶学性质研究主要包括酶的分离与纯化、酶促反应速度的测定、影响酶促反应速度的各种因素等。酶的分离与纯化PPO的分离一般是将生物材料加入适宜的缓冲液进行打浆或研磨提取酶蛋白，然后通过离心（高速冷冻离心）分离得到粗酶液，再通过分级盐析、葡聚糖凝胶（Sephadex）层析及DEAE纤维素离子交换层析等方法进行纯化，可得比活大、纯度高的PPO酶液以进行若干酶学性质研究。PPO活性测定PPO活性测定从理论上讲可以测定底物消耗速度或产物生成速度，但现在人们通常采用测定产物生成速度。不论哪种方法测定的都应是初速度。测定产物生成速度（初速度）一般采用分光光度法，即在一定波长下测定从醌生成的色素的吸光度（A或0.D值），根据吸光度来定义酶活性。对蕨菜多酶氧化酶的活性测定，均是用分光光度法测定0.D值并进行酶活性定义的，不过对不同来源的PPO活性测定人们所采用的波长、底物、反应时间以及具体酶活性定义常常有一定差异，从而导致不同的人研究的PPO活性往往无法进行直接比较。影响酶促反应速度因素的研究影响PPO反应速度的因素主要有pH值、不同温度、不同底物、同一底物不同浓度、抑制剂、激活剂等。文献以及作者对蕨菜PPO酶学性质的研究，均对这些影响酶促反应速度的因素进行了研究。1911-1912年间BernaLd和WeLter沿用Marn的酶提取方法（鲜叶加兽皮粉捣碎，再以乙醇沉淀，最后得到白色干燥粉，即为酶制剂），早期分离得到的酶大多数是不溶性的，活力很低。后来学者通过在提取的过程中加入多酚吸附剂才分离出可溶行的多酚氧化酶。1993年Coggon等人采用液氮低温冷冻提取，pH7.0,加入吐温80或用葡聚糖凝胶G-50，该方法能获得活力较高的可溶性多酚氧化酶。在一般材料中的多酚氧化酶的研究多采用丙酮粉法和缓冲液匀浆