化学发光免疫技术2

化学发光免疫技术永州职业技术学院医学技术系杨晓斌化学发光免疫技术内容免疫学检测的意义检测免疫方法标记免疫技术介绍化学发光免疫分析技术电化学发光原理电化学发光免疫分析技术动画演示全自动电化学发光检测仪的操作程序化学免疫学检测的意义免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种技术，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。如何检测免疫反应？凝集反应：可溶性抗原颗粒性抗原载体抗原致敏颗料凝集凝集如何检测免疫反应？沉淀反应：免疫比浊：第一阶段：Ag-Ab特异性结合，反应快，但不可见介质或固相表面第二阶段：Ag-Ab复合物，在相应的条件下形成可见复合物，反应慢特殊的缓冲液Ag-Ab复合物，在特殊的缓冲液中出现浊度，反应快如何检测免疫反应？标记免疫

在前面的凝集反应中，可溶性抗原通过与载体结合，然后可与相应抗体反应形成肉眼可见的凝集，我们用抗原标记了载体，通过载体放大了凝集反应，这是最基本的标记免疫技术。可溶性抗原载体抗原致敏颗料凝集标记免疫技术标记免疫技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术标记免疫技术常见的标记免疫方法可溶性抗原载体抗原致敏颗料可见或可测定的反应物同位素如I125标记酶如HRP标记荧光染料标记生物素－亲合素标记胶体金标记化学发光物质标记标记物（相当于载体）放射免疫技术酶标记免疫技术荧光标记免疫技术生物素－亲合素标记免疫技术胶体金标记免疫技术化学发光标记免疫技术化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术：

是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。化学发光：是在常温下由化学反应产生的光的发射。其机制为某些化合物（发光剂或发光底物）可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。免疫测定：是利用抗原体反应来测定标本中微量物质的方法。发光的概念什么叫发光？

万物生长靠太阳。地球上的生命，有许多是利用太阳光为能源，来进行一连串的反应。譬如，光合作用、视觉和趋光性等。

在植物或动物中，其吸收太阳光使形成分子的电子激发态，然后由这些激发态开始领着一连串的物理性或化学性的步骤，进行糖的合成，或对周围事物的警觉性，和移动朝向光的性质等，

一种物质由电子激发态回复到基态时，释放出的出的能量表现为光的发射，称为“发光”

电子跃迁物理学中的电子跃迁

电子跃迁就是指原子的外层电子吸收能量超过了所在轨道的能级，而跳跃到离原子核更远的轨道上，但这样的电子不稳定，容易放出能量而返回原来的轨道，这部分放出的能量就表现为荧光。

吸收能量发生跃迁返回基态，把吸收到的能量以光的形式释放这个过程称之为发光激发态轨道基态轨道释放光子发光的类型发光的类型：

1、光照发光，如荧光免疫技术之荧光物质

2、生物发光，如萤火虫发光

3、化学发光，萤火虫荧光素荧光素酶ATP等氧化萤火虫荧光素光荧光物质光能光激发态基态发光剂化学能光激发态基态化学发光什么叫化学发光？

在常温下由化学反应产生的光的发射。

化学发光是一个多步骤的过程，其机制是：某些化合物可以利用化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。发光剂光激发态基态化学能化学发光剂化学发光剂：

在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物。

发光剂分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂化学发光剂释放能量，以发射光子的形式发光剂光激发态基态化学能化学发光剂吸收能量化学发光剂的能量转移过程化学发光剂化学发光剂应具备的条件

1、能参与化学发光反应；

2、与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂；

3、偶联后仍保留高的量子效应和反应动力；

4、应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫活性。常用的化学发光剂或发光底物1、酶促反应的发光底物

是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。

常用的酶有HRP和AP

HRP的发光底物有鲁米诺、对-羟基苯乙酸

AP的发光底物有AMPPD、4-MUP（荧光底物）发光底物光发光底物降解物酶等条件常用的化学发光剂或发光底物2、直接化学发光剂

不需催化剂，只需改变溶液的pH等条件就能发光的物质。

如：吖啶酯（acridinium，AE）吖啶酯光吖啶酯衍生物改变PH有过氧化氢的稀碱溶液常用的化学发光剂或发光底物3、电化学发光剂

是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。

特点：

①反应在电极进行；

②电子供体为：三丙胺（TPA）

③化学发光剂：三联毗啶钌三联毗啶钌分子结构图电化学发光原理在阳电极表面，发光底物为三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+，电子供氢体为三丙胺（TPA）这两化学物质可同时失去电子发生氧化反应。

TPA被氧化成阳离子自由基TPA+●，后者失去一个质子（H+），成为自由基TPA●

，这是一个强还原剂，可将一个电子递给三价的[Ru(bpy)3]2+*，而TPA自身被氧化成TPA氧化产物。激发态的[Ru(bpy)3]2+*在衰减时发射一个波长为620nm的光子，重新生成基态的[Ru(bpy)3]2+

。这一过程可在电极表面周而复始地进行产生许多光子，使光信号增强e-Ru(bpy)3]3+Ru(bpy)3]2+e-TPA+·TPAH＋TPA·二价的[Ru(bpy)3]2＋被氧化成三价[Ru(bpy)3]3＋e－[Ru(bpy)3]2＋*二丙胺和丙醛电化学发光原理电化学发光原理图基态激发态不稳定电化学发光原理电化学发光原理图电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定（ECLI）

是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合的产物。它的标记物的发光原理与一般的化学发光（CL）不同，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，

实际上包括了电化学和化学发光二个过程。ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。ECL不仅可以应用于所有的免疫测定，而且还可用于DNA／RNA探针检测。电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定原理

一、主要试剂构成：

1、标记的抗体：

三联吡啶钌标记抗体

生物素标记抗体

这两种抗体即组成了双抗体夹心法中的两种抗体

2、链霉素亲和素包被磁珠

链霉素亲和素能与生物素紧密结合，链霉素亲和素包被磁珠构成了分离的方法

3、三丙胺（TPA）

三丙胺是电化学发光法的电子供体，使三联吡啶钌形成激发态而放出光子；三丙胺则被氧化为二丙胺和丙醛电化学发光免疫测定技术二、测定的基本过程

1、免疫复合形成生物素标记抗体抗原三联吡啶钌标记抗体三明治式双抗体夹心抗原结构三联吡啶钌抗体抗原抗体生物素抗体电化学发光免疫测定技术2、抗原抗体复合物与磁珠结合三联吡啶钌抗体抗原抗体生物素抗原抗体复合物链霉素亲合素包被磁珠生物素与链霉素亲合素结合三联吡啶钌抗体抗原抗体生物素亲合素磁珠电化学发光免疫测定技术3、磁珠颗粒分离技术进入流动测量池三联吡啶钌抗体抗原抗体生物素亲合素磁珠蠕动泵电极磁铁游离的抗体被吸出流动测量池磁珠被磁铁吸附电化学发光免疫测定技术4、启动电化学发光电极磁铁三丙胺缓冲液产生光子，测定光强度，即可测定待测物含量动画演示反应原理双抗体夹心形成过程动画演示反应原理生物素与亲合素包被磁珠结合动画演示反应原理三联吡啶钌标记抗体－抗原－生物素标记抗体－亲合素包被磁珠复合物动画演示反应原理进入流动测量池，磁珠分离技术，游离抗体被冲走动画演示反应原理电极加电压，启动电化学和化学发光动画演示反应原理发出光子，检测光强度即可求出待测物含量动画演示反应原理终止电压，移出磁珠，清洗流动测量池全自动电化学发光检测仪的操作程序一、检测前准备

检查UPS电源、电脑主机与仪器的接口，检查打印纸是否足够。检查系统试剂、系统水、tip头、cup杯等试剂、耗材是否充足，液体及固体废弃物是否清空，样品针和试剂针是否清洁无弯曲。全自动电化学发光检测仪的操作程序二、标本检测程序开机：

打开中文报告电脑开关及打印机开关，打开中文软件及接收程序，打开UPS电源及仪器保护罩，打开系统试剂盖（procell和cleancell）、仪器显示器电源及主机电源，等待仪器启动及自检。仪器启动后，显示屏上显示：“”，用手指轻触显示屏登陆操作界面。打开试剂仓盖（抓住把手向左旋至OPEN标志，然后移开），放入要测试项目试剂至1-15号试剂位，通用稀释液放在16-18号位置，放好试剂后，盖上试剂仓盖，并旋至LOCK位置。全自动电化学发光检测仪的操作程序扫描试剂：INVENTORY→ReagentScan查看试剂的位置、试剂量，试剂是否需要定标（提示RC标志）及消耗品使用情况。当仪器扫描完成后，屏幕上方显示Stand-by时，在样品盘1-30号位置依次放入待测样本，在最后一个样本后面插上贴有中止码信息的试管。点击ORDER，在SAMPLEID（样本号）、POSITION（测试盘上位置号），输入相应的号，（其中SEQUENCENO.为仪器自动累加计数）输入号后必须按ENTER确认，然后选择所需测试项目（选中为兰色），按Register注册全自动电化学发光检测仪的操作程序按START，开始检测，点击status，观察检测状态。在中文软件中输入病人的相关信息。仪器结果自动传输结果至中文报告电脑，在当日质控在控的情况下，经审核后发出报告。全自动电化学发光检测仪的操作程序

三、仪器分析过程的监控：

在分析过程中，密切注意仪器是否有异常情况出现。若出现异常情况，仪器荧幕最上面会出现黄色或红色的报