2023学年完整公开课版KB法药敏试验

项目二十：扩散法药敏试验知道药敏试验的概念、用途和意义会依据细菌选择相应的抗生素会正确进行扩散法药敏试验会正确使用游标卡尺测量抑菌环的直径能准确判断和分析扩散法药敏试验结果案例导入学习内容讨论：该病人可能是什么细菌感染？为什么常规抗生素治疗无效？有什么好的办法吗？学习内容细菌药物敏感试验的目的K-B法药物敏感试验的影响因素及注意事项进行K-B法药物敏感试验的操作训练，并对结果进行判读和分析药敏试验的概念抗微生物药物敏感试验：是对敏感性不能预测的临床分离株细菌进行药物敏感性检测的试验主要用以指导临床选择治疗药物对细菌耐药性监测网点反馈来的药敏数据进行统计分析，具有监测和发现某细菌耐药性变异趋势的意义药敏试验常用方法纸片扩散法（Kirby-Bauertest）稀释法（dilutiontest）E试验法（Etest）杀菌试验体外联合药物敏感试验K-B法药敏试验原理：将含有抗菌药物的纸片贴在已接种待测细菌的平板相应位置上，药物向琼脂中扩散，形成以纸片为中心的药物浓度梯度分布区，在一定位置上的药物高于抑菌浓度时，细菌不生长而形成透明抑菌圈，抑菌圈越大，细菌对该药物越敏感常用培养基：MH琼脂；90mm平皿；4mm厚度K-B法药敏试验抗菌药物纸片：6.35mm，吸水20μl。（一般用商品纸片）菌液：用生理盐水或营养肉汤取纯培养的菌落制备成浊度为0.5麦氏比浊标准的菌液。K-B法药敏试验方法：将0.5麦氏浊度标准的菌液涂布接种于MH琼脂表面，按纸片间距24mm和边距15mm的标准，加贴相应药敏纸片，35℃培养16-18h，判定结果。操作方法将约56℃恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为90mm的平板，其厚度4mm。无菌挑取孵育16～24h的血平板上4～5个菌落。操作方法置于无菌生理盐水中，校正其浊度于McFarlandNo0.5管。操作方法用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。操作方法操作方法盖上平板的盖子，放置培养箱内，放置3~10min后贴上标准抗生素纸片。操作方法葡萄球菌属青霉素（PEN)苯唑西林（OXA）万古霉素（VAN)替考啦宁（TET)庆大霉素（GEN)红霉素（ERY)四环素（TET)环丙沙星（CIP）克林霉素（CM）复方新诺明（SXT)氯霉素（CHL)操作方法根据待检的菌株挑选相应的抗菌纸片。肠杆菌科细菌哌拉西林(PIP)头孢他啶(CAZ)头孢吡肟(FEP)头孢噻肟(CTX)头孢曲松(CRO)亚胺陪南(IMP)胺曲南(AZT)庆大霉素(GEN)阿米卡星(AMK)四环素(TET)环丙沙星(CIP)左氧氟沙星(LVF)加替沙星(GTF)氯霉素(CHL)复方新诺明(SXT)氨卞西林(AMP)奥格门汀(AVG）头孢唑啉(CFZ)萘啶酸(NAL)头孢呋肟(CXM)肠球菌属细菌青霉素(PEN) 氨卞西林(AMP)万古霉素(VAN)替考啦林(TEL)

红霉素(ERY)四环素(TET)

环丙沙星(CIP)呋喃妥因(FD)

高浓度庆大(GEH)高浓度链霉素(STH)操作方法用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂的表面；各抗菌纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。操作方法经过35℃16～18h孵育。测量抑菌环直径，根据CLSI（美国国家临床实验室标准化委员会）标准，报告细菌对该抗生素敏感(S)、耐药(R)、中介(I)。操作方法结果判定与分析敏感；中介；耐药结果判定与分析结果判定与分析结果判定与分析结果判定与分析结果判定与分析结果判定与分析产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）测定单纸片扩散法（初筛试验）将0.5麦氏单位待检菌液涂抹于MH琼脂平板上稍干后，在琼脂培养基上贴头孢他啶(CAZ)、头孢噻肟(CTX)、头孢曲松(CRO)、氨曲南(ATM)、头孢泊肟(CPD)纸片置35℃过夜培养若抑菌环直径CAZ≤22mm、CTX≤27mm、CRO≤25mm、ATM≤27mm、CPD≤22mm时可疑为产ESBLs菌株单纸片扩散法（初筛试验）产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）测定双纸片协同法（初筛试验）将0.5麦氏单位待检菌液涂抹于MH琼脂平板上稍干后，把含10μg/片克拉维酸纸片（CLA）贴于MH平板中央，克拉维酸纸片周围分别贴上头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、氨曲南、头孢泊肟纸片（纸片中心距离为20～24mm）置35℃过夜培养观察有无协同现象，CLA与任何一种ESC（超广谱β-内酰胺类抗生素）有协同现象者可疑为产ESBL菌株。CLA是克拉维酸，为酶抑制剂，可以抑制ESBL的活性，因此，纸片间会出现协同作用！

ESBL初筛试验结果ESBL确证试验双纸片增效法（确认试验）将0.5麦氏单位待检菌液涂抹于MH琼脂平板上稍干后，在琼脂培养基上分别贴头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟/克拉维酸、头孢曲松/克拉维酸、氨曲南/克拉维酸、头孢泊肟/克拉维酸纸片置35℃过夜培养后量取抑菌环直径与单纸片平皿对照，若加克拉维酸纸片较未加克拉维酸纸片抑菌环直径≥5mm，即为ESBL阳性。ESBL确证试验ESBL确证试验ESBL确证试验说出K-B法试验原理说出药