过程中常见问题及处理方法PPT资料

过程(guòchéng)中常见问题及处理方法第一页，共36页。过程中常见问题及处理(chǔlǐ)方法第二页，共36页。WB的简介(jiǎnjiè)WB即蛋白质印迹法（WesternBlot）。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种(yīzhǒnɡ)实验方法。

第三页，共36页。基本原理通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达(biǎodá)情况的信息。第四页，共36页。

应用1.目的蛋白的表达特性分析2.目的蛋白与其它(qítā)蛋白的互作3.目的蛋白的组织定位4.目的蛋白的表达量分析第五页，共36页。第六页，共36页。第七页，共36页。第八页，共36页。三、WB的影响(yǐngxiǎng)因素步骤较多，任何一步都可能影响结果1、电泳分离蛋白(dànbái)蛋白(dànbái)抽提；蛋白(dànbái)定量；样品制备变性；上样量；电泳（电压、电流的大小，胶浓度、制胶）第九页，共36页。凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡(jìnpào)，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移液浸泡(jìnpào)20min；1、一抗、二抗等不匹配c检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移液浸泡(jìnpào)20min；——增加一抗稀释倍数；第三十三页，共36页。c检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂第三十三页，共36页。第二十一页，共36页。——延长(yáncháng)封闭时间；i一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则(fǒuzé)极易产生较高的背景更换封闭剂（常用(chánɡyònɡ)的脱脂奶、BSA、血清或明胶）3、封闭剂与一抗或二抗有交叉反应目的蛋白与其它(qítā)蛋白的互作特殊(tèshū)处理；2、转膜膜的选择；膜的确认；特殊(tèshū)处理；……第十页，共36页。3、封闭(fēngbì)封闭(fēngbì)液的选择；封闭(fēngbì)条件优化；……第十一页，共36页。4、漂洗漂洗液的配制(pèizhì)与选择漂洗时间及次数第十二页，共36页。5、抗体孵育抗体及稀释液选择；抗体稀释倍数(bèishù)优化；抗体孵育时间；……第十三页，共36页。6、曝光曝光时间(shíjiān)的掌控第十四页，共36页。四、注意事项1.蛋白样品的提取尽可能新鲜组织或蛋白避免反复冻融对于有些蛋白，加去磷酸化的（NaF）尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同(bùtónɡ)提取策略）选择合适的裂解液准确定量（BSA标准蛋白）

第十五页，共36页。第十六页，共36页。2、制胶根据(gēnjù)不同的蛋白大小，选择不同的浓度制胶。第十七页，共36页。制胶的时候一定要注意玻璃板一定要干净，不能有残留(cánliú)的胶。玻璃板底部放平，尽量不能漏胶灌胶的时候，不能太快，容易产生旋窝水或异丙醇压的时候，不能太久第十八页，共36页。

3、转膜a泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移液浸泡(jìnpào)20min；凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡(jìnpào)，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形bPVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡(jìnpào)，活化第十九页，共36页。c膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板，不能放反d转膜过程产生大量的热，注意冷却e具体(jùtǐ)转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，反之则短f避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。第二十页，共36页。g夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则(fǒuzé)会导致转膜不完全h保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大和过小都会影响转膜效率i一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则(fǒuzé)极易产生较高的背景第二十一页，共36页。4、封闭a脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素b如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与印记(yìnjì)膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化c检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂第二十二页，共36页。5、孵育a洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景(bèijǐng)；b注意一抗二抗的匹配c一抗二抗的效价问题第二十三页，共36页。五、常见问题及解决(jiějué)电泳中的问题︶条带呈笑脸状——凝胶不均匀冷却，中间冷却不好;——电泳系统(xìtǒng)温度偏高第二十四页，共36页。︵条带呈皱眉状可能是由于装置不合适(héshì)，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全第二十五页，共36页。拖尾样品(yàngpǐn)溶解不好第二十六页，共36页。纹理（纵向(zònɡxiànɡ)条纹）样品中含有不溶性颗粒第二十七页，共36页。条带偏斜电极不平衡(pínghéng)或者加样位置偏斜第二十八页，共36页。条带两边(liǎngbiān)扩散加样量过多第二十九页，共36页。Westernblot结果曝光(bàoguāng)问题

背景过高且不均匀1、封闭不充分——延长(yáncháng)封闭时间；——更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）2、一抗浓度过高——增加一抗稀释倍数；3、抗体孵育温度过高——4℃孵育第三十页，共36页。4、二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应——设置二抗对照(duìzhào)(不加一抗),降低二抗浓度5、洗膜不充分——增加洗涤次数，增加洗膜次数第三十一页，共36页。没有阳性条带或很弱1、一抗、二抗等不匹配订购试剂时认真(rènzhēn)选取一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物。可通过设置内参可以验证二级测系统的有效性更换更好的一抗二抗第三十二页，共36页。2、一抗或/和二抗浓度低增加抗体浓度；长孵育(fūyù)时间；第三十三页，共36页。3、封闭剂与一抗或二抗有交叉反应封闭时使用温和的去污剂，如TWEEN20更换封闭剂（常用(chánɡyònɡ)的脱脂奶、BSA、血清或明胶）第三十四页，共36页。4、样本(yàngběn)中无靶蛋白或靶蛋白含量过设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能