临床微生物检验流程标准化培训班课件 6-吕火烊-脑脊液及无菌体液培养操作规范

脑脊液及无菌体液培养操作规范检验中心吕火烊lab_lhx@126.com目录•

脑脊液培养操作规范•

无菌体液培养操作规范（除外血液、脑脊液和尿菌）脑脊液培养操作规范•

脑脊液培养意义确定感染性脑膜炎中的病原体；提供抗菌药物选择的依据；评价抗感染治疗的疗效。•

提高脑脊液培养准确性的难点临床送检样本体积相对较少脑脊液中微生物含量较低（103cfu/ml

）操作不当污染不可避免引起急性脑膜炎的普通细菌•

大肠埃希菌、无乳链球菌(B群新生儿链球菌)、单核细胞李斯特菌＜2个月

•

无乳链球菌、单核细胞李斯特菌、大肠埃希菌＜10岁

•

流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌引起急性脑膜炎的普通细菌•

脑膜炎奈瑟菌青少年•

肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌成人•

肺炎链球菌、革兰阴性杆菌、单核细胞李斯特菌老年人•

CoNS、金黄色葡萄球菌、棒状杆菌属、痤疮丙酸中枢神经系统分流术后感染/脑室炎杆菌、需氧革兰阴性杆菌、其它厌氧菌可引起中枢系统感染的其他病原体病毒：单纯疱疹病毒、肠道病毒、西尼罗病毒等细菌：结核分枝杆菌、诺卡菌属、支原体、柔氏螺旋体、埃立克体属等真菌：新型隐球菌、球霉菌属和荚膜组织胞浆菌等原虫：棘阿米巴原虫脑脊液培养对样本采集的要求•

腰椎穿刺或

Ommaya储液囊液体或脑室引流液（医生操作）•

至少采集3管，要求每管：≥3.0

ml第1管：生化常规（总蛋白、葡萄糖等）第2管：微生物学（培养、涂片、PCR）第3管：血液学（细胞计数等）脑脊液培养对样本量的要求•

成人与儿童细菌培养+涂片革兰染色：≥1.0

ml病毒培养：

≥0.5

ml隐球菌抗原+墨汁染色：

≥1.0ml真菌培养+荧光染色：

≥3.0

ml（疑似慢性脑膜炎的患者，为明确排除真菌感染，需要提供多达3管单独的脑脊液样本用于真菌培养。）AFB培养+抗酸染色：

≥3.0

ml（疑似慢性脑膜炎的患者，为明确排除AFB感染，需要提供多达3管单独的脑脊液样本用于AFB培养。）脑脊液培养对样本量的要求•

成人与儿童（特殊病原体）亚急性海绵状脑病(14-3-3蛋白)：≥3.0

ml病毒PCR：

≥1.0

ml西尼罗病毒：

≥1.0ml棘阿米巴原虫：

≥10.0

ml厌氧培养+革兰染色：

≥1.0ml脑脊液培养对样本量的要求•

新生儿细菌培养+涂片革兰染色：≥0.5

ml病毒培养：

≥0.2

ml培养样本采样后均应即时送检培养基及培养环境要求1.常规细菌培养•

培养基：哥伦比亚血琼脂平板、巧克力平板；巯基乙酸肉汤（或儿童血培养瓶）•

培养环境：35-37℃，5-8%CO

气体，培养48-96小时22.厌氧菌培养•

培养基：布氏血琼脂平板、厌氧血培养基（瓶）•

培养环境：35-37℃，厌氧环境，培养至7天3.真菌培养•

培养基：沙保弱琼脂平板、儿童血培养瓶•

培养环境：28-30℃，空气、湿度不小于70%，培养至7天脑脊液细菌培养的处理样本量极少（﹤0.2

ml）与临床沟通，优先检测最需要的项目其他部门可以获取多余样本其他部门无法获取多余样本获取的样本抗酸染色可培养的样本用无菌移液枪头取20l涂片（切勿涂开），于生物安全柜内自然（干片机）干燥，甲醇固定后，行革兰或抗酸染色在余下样本管中加入0.5ml普通肉汤，混匀后，所有肉汤样本分别肉汤涂片、接种血平板、巧克力平板、麦康凯平板，并35℃-37℃

CO

环境中培养，每天观察墨汁染色2结果，至4天。脑脊液细菌培养的处理样本量少（0.2～1.0ml）与临床沟通，优先检测最需要的项目其他部门可以获取多余样本其他部门无法获取多余样本获取的样本抗酸染色可培养的样本用无菌移液枪头取20l涂片（切勿铺开），于生物安全柜内自然（干片机）干燥，甲醇固定后，行革兰或抗酸染色用无菌移液枪头分别取20

接种血平板、巧克力l革兰染色平板、麦康凯平板，35℃-37℃

CO2养，每天观察结果，至天。环境中培墨汁染色4革兰染色与抗酸染色的处理方法如前所述余下样本全部接种于增菌肉汤，有条件的单位可接种于儿童血培养瓶中，培养7天后报告结果脑脊液细菌培养的处理样本量1.0～3.0

ml用无菌移液枪头分别取20

l接种血平板、巧克力平板、麦康凯平板，

35℃-37℃

CO

环境中培养，每天观察结果，至4天。

不小于50

l接种沙保弱平板，

25℃-30℃

普通环境中培养，每天观察结果，至7天。视样本量，分别在细胞离心机二个加样室中加不小于250

l样本及1滴37%福尔马林，按制造商的离心操作规程操作2所得涂片，甲醇固定后，用于革兰染色与抗酸染色墨汁染色余下样本全部接种于增菌肉汤，有条件的单位可接种于儿童血培养瓶中，培养5天后报告结果所有检测均遵医嘱进行脑脊液细菌培养的处理样本量足够（≥3.0ml）用无菌移液枪头分别取20

l接种血平板、巧克力平板、麦康凯平板，

35℃-37℃

CO

环境中培养，每天观察结果，至4天。

不小于50

l接种沙保弱平板，

25℃-30℃

普通环境中培养，每天观察结果，至7天。视样本量，分别在细胞离心机二个加样室中加不小于1.0ml样本，按制造商的离心操作规程操作2所得涂片甲醇固定后，用于革兰染色与抗酸染色墨汁染色余下样本全部接种于增菌肉汤，有条件的单位可接种于儿童血培养瓶中，培养5天后报告结果所有检测均遵医嘱进行脑脊液厌氧菌培养的处理样本量少（﹤2.0ml）用无菌移液枪头分别取不小于100

l接种厌氧血平板于厌氧环境35℃-37℃

培养，每天观察结果，至7天。示样本量，在细胞离心机加样室中加不小于250l样本，按制造商的离心操作规程操作所得涂片甲醇固定后，用于革兰染色剩余样本接种厌菌肉汤培养，如有条件的单位可将剩余样本接种于厌氧血培养瓶中，在血培养仪中培养7天后报告结果所有检测均遵医嘱进行脑脊液厌氧菌培养的处理样本量足够（≥3.0ml）用无菌移液枪头分别取不小于100

l接种厌视样本量，在细胞离心机加样室中加不小于1.0ml样本，按制造商的离心操作规程操作氧血平板、和普通血平板，厌氧血平板于厌氧环境35℃-37℃

培养，每天观察结果，至7天。

普通血平板，

35℃-37℃

普通环境中培养，每天观察结果，至4天。所得涂片甲醇固定后，用于革兰染色如有条件的单位可将不小于1.0ml样本直接接种于厌氧血培养瓶中，在血培养仪中培养7天后报告结果所有检测均遵医嘱进行脑脊液其他病原体的处理结核分枝杆菌的检测推荐使用PCR法病毒检测推荐使用PCR法隐球菌感染培养样本量要足够，沙保弱培养基25～30℃，普通环境培养至少5天二代测序在脑脊液病原学检测中应用脑脊液细菌培养的鉴定与药敏试验•

1.所有可见生长的微生物均需鉴定并及时报告临床•

2.微生物的鉴定可依据各实验室使用的方法鉴定到种•

3.依据细菌在平板上生长的特性，通过革兰染色、氧化酶、触酶等可在2小时内初步确定属或种•

4.如果分离的菌株明显是平板污染菌，或者仅在肉汤中分离到凝固酶阴性葡萄球菌

(CoNS)，则不需要完成全部鉴定或抗生素敏感性试验(AST)•

5.

如CoNS和棒状杆菌属分离株，来自分流术感染和头部外伤患者中应及时与临床联系确定是否需进行一步鉴定与药敏脑脊液细菌培养的鉴定与药敏试验•

6.对肠道和非发酵革兰阴性杆菌、肠球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、和其它有意义的葡萄球菌进行AST检测•

7.

流感嗜血杆菌：检测β-内酰胺酶。如果β-内酰胺酶试验阴性，AST试验检测青霉素和氨苄青霉素，这两种药物均可用于治疗•

8.

李斯特菌属、无乳链球菌和脑膜炎奈瑟菌，通常不进行AST或β-内酰胺酶检测，否则可能导致错误结果。以上菌属的青霉素耐药株很少见；若检测到非青霉素敏感菌株，需送至参考实验室确认•

9.对青霉素过敏的患者，与临床医生沟通后进行AST检测结果报告•

报告时限要求（分级报告）尽快报告革兰染色结果，通常在接收标本1小时之内初步试验完成后，立即报告可能的属和种对于阳性结果，书面通知临床医生•

报告方式：涂片结果：XX染色找到XX类型细菌；

XX染色未找到XX细菌说明：样本的性状、样本量、涂片方式（直接还是离心）培养结果：培养XX天无细菌生长培养XX天，XX细菌，药敏结果（如果需要）说明：是直接样本接种还是肉汤增菌后接种结果解释•

通常培养阳性表明有微生物感染。•

脑脊液中未观察到WBCs不能排除感染，特别是李斯特菌感染所致疾病。•

最常见的社区获得性细菌性脑膜炎的致病菌是肺炎链球菌。对于革兰染色所见α-溶血链球菌，快速胆汁溶菌试验或荚膜膨胀实验是重要的快速诊断方法。•

脑脊液中若分离到肠球菌需引起注意。检测到肠球菌提示可能为类圆线虫病。•

假阳性结果可能来自标本污染，或皮肤微生物群污染。•

假阴性结果可能由于微生物的数量太少，之前进行抗生素治疗，或感染的微生物难以培养。样本保存•

检测剩余的脑脊液在4度和/或在-20度保存一周，用于PCR和其它后续申请。•

对阳性培养平板至少保存7天，或冷冻菌株以便更长时间保存。脑脊液培养给临床医生的建议•

脑脊液的常规微生物学检测（检测细菌性脑膜炎），应进行以下项目申请：脑脊液总蛋白和葡萄糖；

细菌培养和染色•

脑脊液特殊微生物检测，应进行以下项目申请：脑脊液总蛋白、葡萄糖、细胞计数、血葡萄糖；细菌、厌氧菌、真菌培养、革兰染色、抗酸染色、墨汁染色；隐荚膜抗原检测、病毒及结核分枝杆菌PCR检测；棘阿米巴原虫的检测无菌体液培养操作规范（除外血液、脑脊液和尿菌）定义：这里的无菌体液是指来自于身体正常无菌部位的液体，包括：滑膜液（关节液）、胸腔积液（胸水）、腹膜液（腹水）、心包积液、盲管液（盘腔积液）和羊水特别说明：“盲管”是指盲袋直肠前壁与后壁的腔隙；积液经阴道后穹窿穿刺采集常见病原体关节液胸腔积液腹膜液•

金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、厌氧菌•

淋病奈瑟菌、布氏菌属、金氏金杆菌•

革兰阴性杆菌、葡萄球菌属、链球菌属•

厌氧菌、分枝杆菌、诺卡菌属、军团菌属、真菌、阿米巴等•

葡萄球菌属、-溶血链球菌、非发酵菌、革兰阴性杆菌•

厌氧菌、念珠菌属、其他真菌常见病原体心包液

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金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌及其他-溶血链球菌、革兰阴性杆菌、结核分枝杆菌、真菌等•

柯萨奇病毒、流感病毒、阿米巴等盲管液

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厌氧菌、革兰阴性杆菌、葡萄球菌属、链球菌属、淋病奈瑟菌等•

衣原体、支原体、真菌、病毒等•

革兰阴性杆菌、葡萄球菌属、-溶血链球菌、淋病奈瑟菌等羊水•

厌氧菌、衣原体、支原体、真菌、病毒等样本采集基本要求•

抗菌药物使用前采集•

严格无菌操作•

建议使用穿刺法采集（细菌培养不建议使用引流的样本）•

采集足够的样本量•

及时送检培养基及培养环境要求1.常规细菌培养•

培养基：哥伦比亚血琼脂平板、巧克力平板、MAC、EMB；需氧血培养瓶、厌氧血培养瓶•

培养环境：35-37℃，5-8%CO引流液培养2天2气体培养，穿刺液培养4天，2.厌氧菌培养•

培养基：布氏血琼脂平板、

哥伦比亚粘菌素奈啶酸琼脂平板(CAN)、苯-酒精琼脂平板、厌氧血培养基（瓶）•

培养环境：35-37℃，厌氧环境，培养至7天3.真菌培养•

培养基：沙保弱琼脂平板、需氧血培养瓶•

培养环境：28-30℃，空气、湿度不小于70%，培养至7天无菌体液细菌培养的处理用采样针筒穿刺抽取足够样本量直接打入需氧血培养瓶、厌氧血培养瓶（打入针管中至少保留0.5ml，的样本量视所用培养瓶的使用说明），一般不直接送到细菌室用于染色及直接平板接种，接种二块血平板，二巧克力平板，一组在35℃-37℃

CO

环超过10ml，在血培养仪中培养至7天2境中培养，一组在厌氧环境培养、每天观察结果，至4天需氧瓶阳性厌氧瓶阳性抽取阳性瓶中样本，涂片革兰染色，接种二块血平板，二巧克力平板，一组在35℃-37℃

CO

环境中培养，一组在厌氧环境培养、每天观察结果，至4天抽取阳性瓶中样本，涂片革兰染色，接种一块血平板，巧克力平板，

35℃-37℃样本如果为腹膜液，其厌氧瓶阳性还应接种MAC、EMB、CAN(哥伦比亚粘菌2CO

环境中培养，每天素奈啶酸琼脂平板)、苯酒精琼脂平板2观察结果，至4天涂片方法:在酒精清洗过的玻璃片上加1-2滴样本，不用涂开，自然干燥涂片结果及时告诉临床，常规鉴定与药敏无菌体液细菌培养的处理用采样针筒穿刺抽取样本量少记录样本量，外观及凝固性样本量只有1-2滴

样本量大于（

<20l

）0.5ml只收到大于2ml样本，

样本量只有2-3滴，如果只收到血培养瓶样本无血培养瓶无厌氧瓶抽取瓶中样本（

≥0.5ml）接种巧克力平板以培养淋球菌只接种巧克力平板，

剩余样本抽洗到肉汤培养基中，不用涂片，记录样本量于报告中取2-3滴（约20-30l）样本接种血平板和巧克力平板取1ml样本到10ml肉汤培养基中先进行需氧培养，

样本如果为腹涂片染色，如果样本量足够多接膜液或透析液，且送检样本在种厌氧血培养瓶，

厌氧环境中的，量不应少于厂家推荐的体积将样本接种厌氧培养基中涂片方法:在酒精清洗过的玻璃片上加1-2滴样本，不用涂开，自然干燥平板上菌落涂片染色、所有涂片结果及时告诉临床，常规鉴定与药敏无菌体液细菌培养的处理•

关于引流管标本的处理•

注意:不支持送检引流管样本,因为这容易被皮肤定值菌污染。最好直接吸取流出的液体标本。•

消毒采集管：并无菌吸取引流管中液体。•

无菌密封杯运送。•

不要将引流液接种血培养瓶，因为这种方式不太可能提高致病菌的检出率。注意:不能用棉签送检，因为样品的数量可能不足以确保培养出少量的生物。无菌体液细菌培养的处理结核分枝杆菌的检测推荐使用PCR法衣原体、病毒检测推荐使用PCR法其他特殊的病原体的检测依据相关标准使用合适的培养基和培养环境二代