控制菌检查法

中药制剂分析技术控制菌检查法ShandongCollegeofTraditionalChineseMedicine控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检査供试品中是否存在特定的微生物。

本法包括大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、梭菌以及白色念珠菌的检查。非无菌的口服药品不得检出大肠埃希菌；外用药品和眼科用制剂不得检出铜绿假单胞菌供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。控制菌检查法一、控制菌检查用培养基的适用性检查1.菌种（6种）

大肠埃希菌〔CMCC(B)44102〕金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕乙型副伤寒沙门菌〔CMCC(B)50094〕铜绿假单胞菌〔CMCC(B)10104〕生孢梭菌〔CMCC(B)64941〕白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕

成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。控制菌检查法2.菌液制备控制菌检查法大肠埃希菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌乙型副伤寒沙门菌分别接种胰酪大豆胨液体（或琼脂）培养基30～35℃培养18～24小时

2.菌液制备控制菌检查法白色念珠菌接种20～25℃培养2～3天沙氏葡萄糖琼脂（液体）培养基上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0的无菌磷酸盐缓冲液制成适宜浓度的菌悬液。生孢梭菌接种梭菌增菌培养基厌氧条件下30～35℃培养24～48小时

硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃培养18～24小时

3.适用性检查项目：促生长能力抑制能力指示能力具体方法参照中国药典2015年版附录。控制菌检查法二、控制菌检查方法适用性试验控制菌检查法1.供试液制备按下列“供试品检査”中的规定制备供试液。2.试验菌根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应试验菌株，确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法时，采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。3.适用性试验：控制菌检查法规定量供试液≤100cfu试验菌规定的培养基依法检查过滤冲洗规定量供试液加试验菌过滤注入培养基滤膜接入培养基中采用薄膜过滤法4.结果判断：上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的检查；如未检出试验菌应消除供试品的抑菌活性，并重新进行验证。控制菌检查法控制菌检查法1.耐胆盐格兰阴性菌供试液的制备和预培养胰酪大豆胨液体培养基20～25℃供试品约2小时培养1:10供试液定性试验肠道菌增菌液体培养基30～35℃10ml上述培养物18～24h培养无菌落生长未检出耐胆盐格兰阴性菌三、检查方法控制菌检查法定量试验选择和分类培养肠道菌增菌液体培养基30～35℃1:10预培养物24～48h培养紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基1:100预培养物1:1000预培养物分别接种划线接种30～35℃18～24h培养结果判断培养管为阳性平板上有菌落生长平板上无菌落生长培养管为阴性查表知耐胆盐格兰阴性菌的可能数量2.大肠埃希菌(Escherichiacoli)增菌培养阳性对照阴性对照控制菌检查法胰酪大豆胨液体培养基30～35℃1:10供试液10ml18～24h培养1ml大肠埃希菌液胰酪大豆胨液体培养基18～24h30～35℃培养10ml稀释液18～24h培养胰酪大豆胨液体培养基30～35℃选择和培养控制菌检查法100ml麦康凯液体培养基42～44℃1ml上述培养物24～48h培养取培养物划线接种麦康凯琼脂培养基30～35℃18～72h结果判断控制菌检查法MaCC平板上有菌落生长分离纯化鉴定试验确认未检出大肠埃希菌MaCC平板无菌落生长有菌落生长但鉴定结果为阴性革兰氏染色镜检：革兰阴性无芽孢杆菌适宜的鉴定试验：发酵乳糖产酸；IMViC实验反应为++−−或−+−−检出大肠埃希菌3.沙门菌(Salmonella)控制菌检查法供试液的制备和增菌培养选择和分离培养供试品10g或10ml胰酪大豆胨液体培养基18～24h培养30～35℃18～24h30～35℃培养上述0.1ml培养物10mlRV沙门增菌液体培养基少量培养物划线接种木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基18～48h培养30～35℃接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基高层斜面斜面和高层穿刺接种培养18～24h控制菌检查法结果判断若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄色；或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证如平板上无菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层未见黄色或黑色，判供试品未检出沙门菌。4.铜绿假单胞杆菌(Pseudomonasaeruginosa)控制菌检查法溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基1:10供试液10ml胰酪大豆胨液体培养基18～24h培养30～35℃划线接种18～72h培养30～35℃氧化酶试验取平板上的菌落氧化酶试验：培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色阳性洁净滤纸片置平皿内将菌落用玻棒涂于滤纸片滴加新制新制1%二盐酸N,N-二甲基对苯二胺试液30s内结果判断溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上有菌落生长，且氧化酶试验阳性，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌。如果平板上无菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或氧化酶试验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。控制菌检查法5.金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)控制菌检查法1:10供试液划线接种胰酪大豆胨液体培养基甘露醇氯化钠琼脂培养基18～24h培养30～35℃18～72h培养30～35℃未检出金黄色葡萄球菌无菌落生长革兰氏染色+血浆凝固酶试验非G+球菌和血浆凝固酶试验阴性有菌落生长未检出金黄色葡萄球菌6.梭菌(Clostridium)控制菌检查法梭菌增菌培养基分别接种1:10供试液80℃保温10分钟后迅速冷却1:10供试液取少量培养物厌氧条件培养48h30～35℃涂抹接种于哥伦比亚琼脂培养基厌氧条件培养48h～72h30～35℃控制菌检查法滴加3%H2O2试液取平板上的菌落置洁净玻璃片菌落表面有气泡产生菌落表面无气泡产生阳性阴性过氧化氢酶试验结果判断若哥伦比亚琼脂培养基平板上有厌氧杆菌生长（有或无芽孢），且过氧化氢酶反应阴性的，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为梭菌；如果哥伦比亚琼脂培养基平板上没有厌氧杆菌生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但鉴定结果为阴性，或过氧化氢酶反应阳性，判供试品未检出梭菌。7.白色念珠菌（Candidaalbicans）念珠菌显色培养基1:10供试液未检出沙氏葡萄糖液体培养基无菌落生长有菌落生长未检出阴性阳性控制菌检查法3～5天培养30～35℃取培养物划线接种沙氏葡萄糖琼脂培养基24h～48h培养30～35℃接种进一步确证四、微生物限度标准口服给药制剂不得检出大肠埃希菌。局部给药制剂不得检出控制菌金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。鼻及呼吸道吸入给药制剂还不得检出大肠埃希菌，阴道、尿道给药制剂还不得检出梭菌和白色念珠菌。含动物组织(包括脏器提取物)及动物类原药材