DB65T 3899-2016高致病性猪蓝耳病RT-PCR检测方法

高致病性猪蓝耳病RT-PCR检测方法RTPCRdetectionmethodforh2016-06-10发布新疆维吾尔自治区质量技术监督局发布I本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定编写。1件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。合成cDNA,再以cDNA为模板，扩增合成目的片25.4氯仿-异戊醇(49:1)混合溶液。5.5反转录酶(200U/μL)。5.10加样缓冲液：见附录A.6。5.13DEPC处理的灭菌双蒸水配置的75%乙醇：见附录A.8。5.19实验用水均为蒸馏水，规格符合GB/T6682-2008的相关规定。高速冷冻离心机(最高转速应大于12000rpm),组织研磨器或研钵，PCR扩增仪，核酸电泳仪水平电泳槽，恒温水浴锅，2℃~8℃冰箱和-20℃冰箱，微量移液器(0.5HL～10H;2HL～20μL;20~200μ;100μL～1000μ),凝胶成像系统(或紫外透射仪),超净工作台或通风橱，生物安全柜。冷藏并在24h内送至实验室检测，或在-20℃的环境中保存备用。若需长期保存，应将样品置于-70℃7.2.1取组织样品进行研磨匀浆后冻融2次，5000rpm/min离心5min。3续加入30μl2mol/L乙酸钠(pH值4.0)。反复颠倒离心管5次，在室温下放置5min。12000rpm/min、4℃离心15min并取上清。7.2.8将含有RNA沉淀的离心管静置干燥沉淀5min～10min,然后用20μLDEPC水(或无核酸酶水)将沉淀充分溶解，冰上保存并在2h内进行RT-PCR扩增或在-20℃条件下保存备用。94℃2min,然后进入35个扩增循环：94℃30s,56℃45s,68℃45s,最后68℃延伸8min,产物4℃保7.4.1制备1.5%琼脂糖凝胶板，见附录A.3。7.4.4盖好电泳仪，插好电极，电压5V/cm,电泳20min～30min。8结果判定在阳性对照同时出现230bp(HP-PRRSV)和320bp(美洲型)的扩增带、阴性对照无相应目标条带，待检样品出现230bp的扩增条带，判定为HP-PRRSV阳性；待检样品出现320bp的扩增条带，判定为美洲型PRRSV阳性；同时出现230bp、320bp的目标条带，则判定为HP-PRRS和美洲型PRRSV双阳性现230bp和320bp条带则判定为高致病性蓝耳病和经典美洲4(规范性附录)将250g异硫氰酸胍、17.6mL0.75mol/L(pH7.0)柠檬酸钠和26.4mL10%(m/V)十二烷基磺酸钠溶293mL水中。65℃条件下搅拌、混匀，直至完全溶解。室温条件下保存，每次使用前按每50mL用琼脂糖1.0g,1×TAE电泳缓冲液100mL,混匀后在微波炉中完全融化，待冷至50℃~60℃时，在100mL容量瓶中，先EDTANapH三羟甲基氨基甲烷(Tris)242g、冰乙酸57.1mL、0.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)100mL,加灭菌双5DEPC100μL,加超纯水至100mL,室温过夜，121℃高压15min,分装到1.5mLDEPC处理过的微量管中，冻存备用。A.875%乙醇(用DEPC水配置)用75mL无水乙醇，加DEPC水至100mL,混匀，4℃保存备用。A.9.1HP-PRRSV和美洲型PRRSV检测引物序列如表A.1。表A.1HP-PRRSV和美洲型PRRSV检测引物序列序列上游引物PRRST15'-TGATGGGCGACAATGTCC-3'下游引物PRRST25'-CGCAGAGAAATCCAGAGG-3'A.9.2引物合成后短期内可4℃存放，需长期保存应冻存于-20℃。待用时应稀释至20pmol浓度。扩增时2条引物在同一体系中，扩增结束后出现大小为230bp的目的片段为HP-PRRSV,大小为320bp的目的片段则为美洲型PRRSV。6(资料性附录)检测过程中生物安全和防止交叉污染的措施B.1样品处理和核酸制备B.1.1样品处理过程中应穿实验服，戴一次性手套、口罩、帽子。一次性PE手套应经常更换。B.1.2提取RNA过程或PCR反应液配制过程应分别在专用的超净工作台内进行。B.2.1实验前后，应将超净工作台的紫外灯打开照射30min;也可用10%次氯酸钠溶液或其它消毒剂擦拭工作台面，应保持工作台面和环境的清洁干净。理后，121℃,15min高压灭菌并烘干后才可使用