蛋白质化学及代谢-氨基酸性质

第三单元蛋白质化学及代谢氨基酸的性质一、氨基酸的物理性质1.溶解性无色晶体，水中溶解度各不同，取决于侧链。2.熔点熔点较高（200-300℃）。3.光吸收在紫外有特征吸收的仅三个芳香族的氨基酸Trp、Tyr、Phe,利用这一特点，可以通过测定280nm处的紫外吸收值的方法对蛋白溶液进行定量。Trp,Tyr和Phe的紫外吸收

4.旋光性除Gly外，其它的氨基酸都有旋光性。

如含两个手性碳原子，则有４种立体异构体，分别称为Ｄ-,Ｌ-，Ｄ别-和Ｌ别-氨基酸。L-苏氨酸(L-threonine)D-苏氨酸(D-threonine)L-别-苏氨酸(L-allo-threonine)D-别-苏氨酸(D-allo-threonine)

组成蛋白质的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子，所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋转，向左旋转的称左旋，用“―”号表示，向右旋转的称右旋，用“＋”号表示。

消旋外消旋内消旋L-胱氨酸D－胱氨酸内消旋胱氨酸二、氨基酸的酸碱性质1、氨基酸的两性离子形式

氨基酸在晶体或水溶液中通常以两性离子(dipolarion)形式存在。同一个氨基酸分子上可以即有正电荷又有负电荷，故称为两性电解质，可进行两性解离。熔点：高溶液介电常数：增加2、等电点BrÖnsted-Lowry的酸碱理论，即广义酸碱理论。HAA-+H+酸碱质子氨基酸在水中的两性离子形式既能像酸一样放出质子，也能像碱一样接受质子，氨基酸具有酸碱性质，是一类两性电解质。Asanacid（protondonor）：Asabase（protonacceptor）：不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在：

正离子两性离子负离子在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（isoelectricpoint），以pI表示。在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在，但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。当溶液的pH=pI时，AA主要以两性离子形式存在。pH<pI时，AA主要以正离子形式存在。pH>pI时，AA主要以负离子形式存在。3．氨基酸的酸碱滴定曲线

Henderson-Hasselbalch方程pH=pKa+lg[质子受体][质子供体]酸碱滴定曲线pK1为-COOH（4-5）解离，pK2-NH3（10-11）解离﹢氨基酸的酸碱滴定4．等电点的计算

K1=[Gly±][H+][Gly+]K2=[Gly-][H+][Gly±]pI时，[Gly+]=[Gly-][Gly±][H+]K1=[Gly±]K2[H+][H+]2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI=（2.34+9.60）/2=5.97Gly酸性氨基酸，以Asp为例：碱性氨基酸，以Lys为例：5.氨基酸的甲醛滴定法氨基酸不可直接用酸、碱滴定进行定量测定，因为滴定终点的pH过高（11-13）或过低（1-2），无适当的指示剂。加入过量的甲醛可降低氨基的碱性，相对增加-NH3酸性，使氢氧化钠滴定的终点下移至pH9附近，可用酚酞指示。三、氨基酸的化学性质1.α-氨基的化学反应:

(1)与亚硝酸的反应

VanSlyke定氮

(2)与甲醛的反应

氨基滴定

(3)与酰化基的反应

氨基保护基

(4)与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应

(5)与二甲基氨基萘磺酰氯(DNS-Cl)的反应

(6)与Edman试剂(苯异硫氰酸酯,PITC)反应

（7）与醛形成西佛碱

（8）酶氧化脱氨(1)与亚硝酸的反应(VanSlyke定氮)α-氨基3-4min，其他氨基也能反应,速度较慢。（2）与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法R—CH—COO-NH3+R—CH—COO-NH2+H+OH-中和滴定HCHOR—CH—COO-NHCH2OHHCHOR—CH—COO-N(CH2OH)2（3）酰基化反应酰氯：苄氧甲酰氯（Cbz-Cl）:对甲苯磺酰氯(Tos-Cl):叔丁氧甲酰氯(Boc-Cl):酸酐：邻苯二甲酸酐：（R’＝酰基）X=卤素（Cl、F）（4）与2,4-二硝基氟苯(DNFB，Sanger试剂)的反应弱碱性DNP-氨基酸取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高(5)与丹磺酰氯的反应（6）与异硫氰酸苯酯（PITC，Edman试剂）的反应无水HFPITCPTC-氨基酸PTH-氨基酸（7）与醛形成西佛碱

（8）酶氧化脱氨R′C=O+HR′H2NCHHR′COOHC=NCHHR-H2O+H2O2.α-羧基的化学反应

(1)成盐和成酯反应羧基保护

(2)酰氯化反应羧基活化

(3)叠氮反应合成肽

(4)与肼(hydrazine)的反应C端氨基酸分析（1）成盐反应R—CH—COOH+NaOHNH2R—CH—COONaNH2（2）成酯反应R—CH—COOH+C2H5OHNH2HCl气R—CH—COOC2H5NH2当羧基变成乙酯后，羧基的化学性质就被掩蔽了，而氨基的化学性质就突出地显示出来。（3）酰氯化反应

使氨基酸的羧基活化，易于另一氨基酸的氨基结合，在合成肽的工作上常用。（4）叠氮反应H2N-CHR-COOHYHN-CHR-COOH酰化氨基酸YHN-CHR-COOCH3酰化氨基酸甲酯NH2NH2（-CH3OH）YHN—CHR—CO—NH—NH2酰化氨基酸的肼衍生物HNO2YHN—CHR—CON3+2H2O酰化氨基酸叠氮3.α-氨基和α-羧基共同的反应

(1).与茚三酮(ninhydrin)的反应氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物(Pro为黄色)，最大吸收峰在570nm（Pro440nm）处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法（μg）。

茚三酮还原茚三酮第二个茚三酮紫色化合物的两个共振形式(2).成肽反应4.侧链R基的化学反应（1）-S-S-和-SH的氧化还原反应R-SH：HS-CH2CH2OH巯基乙醇（mercaptoethanol）HS-CH2COOH巯基乙酸（mercaptoaceticacid）HS-CH2(CHOH)2-CH2SH二硫苏糖醇（DTT）

半胱氨酸的-SH很活泼，很容易在空气中重新氧化形成二硫键，一般可用卤代化物（碘乙酸，碘乙酰胺）对-SH进行保护。半胱氨酸的巯基可打开乙撑亚胺（氮丙啶）的环HHOOC-C-CH2-SH+NH2H2CNHH2C

HHOOC-C-CH2-S-CH2-CH2-

NH2NH2（AECys）半胱氨酸与二硫硝基苯甲酸（DTNB）或称Ellman试剂反应，硫硝基苯甲酸，412nm有光吸收。S—SCOOHO2NHOOCNO2半胱氨酸巯基能和多种金属离子形成络合物，如对氯汞苯甲酸。COOHHgHHOOC—C—CH2—SNH2（2）苯环的黄色反应Phe+少量浓H2SO4+浓HNO3

黄色TyrTrp+浓HNO3

黄色or（3）酚基的Millon反应（米伦氏反应）HgNO3

Tyr+Hg(NO3)2

红色HNO3

（4）pauly反应His+重氮苯磺酸红色（棕红色）Tyr+重氮苯磺酸橘黄色（5）Folin一酚反应+磷钼酸Tyr磷钨酸Trp蓝色（钼蓝与钨蓝混合物）（6）Arg的侧链反应可与环己二酮或丁二酮生成可逆的缩合物。四、氨基酸的分析分离氨基酸的分析分离工作是测定蛋白质结构的基础，分离和定量测定蛋白质水解液中的各种氨基酸是一项艰巨的任务。层析是利用混合物中各组分的理化性质的差别，使各组分以不同程度分配在两相（固定相和流动相）中，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。分配系数Kd=CACBCA：一种物质在A相（流动相）中的浓度CB：一种物质在B相（固定相）中的浓度分配层析原理（分配定律）：当一种溶质在两种一定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，它在这两种溶剂中的浓度比值与在这两种溶剂中的溶解度比值相等，这个比值是个常数，称分配系数K（1）逆流分溶（逆流分配）

（2）纸层析单向纸层析图Rf值

双向纸层析图

（3）薄层层析（4）离子交换层析法

原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。这种分离主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与极性，非极性有关。离子交换树脂：