《生物实验技术》第五章 非切片法的制作

第五章非切片法的制作第一节整体制片法第二节涂片法*第三节分离法第四节铺片法第五节滴片法*第六节压片法自学染色：甲基绿、碘液、1%美兰第一节整体制片法二、半永久和永久性制片一、临时制片第五章1.甘油封片法5%甘油标本蒸发2-3天

载片

怕压、易碎标本：2.甘油胶封片法

避免蒸发或流动：最适合于柔软易碎材料。材料固定、水洗5%甘油2h10%甘油1h

甘油胶封片石蜡或漆封边

玻璃丝

（直径0.2-0.5mm

）第一节整体制片法第五章3.甘油或甘油胶-树胶双封片法材料要观察的面朝向大盖片

盖玻片载玻片盖玻片的小片朝下封于载片上

第五章第一节整体制片法甘油或甘油胶封片中性树胶封片4.聚乙烯醇封片法

新鲜和固定的标本

小而透明的标本用木素粉红或酸性品红染色

乳酸和石炭酸等量混合剂配4%、5%、10%

甲壳动物、单殖吸虫、寄生线虫、棘头虫及动物中粘孢子

单殖吸虫棘头虫第五章第一节整体制片法寄生线虫鱼体表粘孢子虫棘头虫

30%Alc→40%Alc→50%Alc→60%Alc→70%Alc

→80%Alc→95%

Alc→100%Alc→100%Alc→纯酒精/二甲苯2：1→1：1→1：2→纯二甲苯（1）原生动物(或小型浮游生物)整体封片法材料特点：在液体培养基中培养或制备成的悬液弃培养液各级酒精脱水、二甲苯透明封片固定液离心离心中性树胶弃上清液第一节整体制片法第五章5.树胶封片法

离心机的转速纽虫肝片吸虫肝片吸虫华枝睾吸虫材料特点：身体扁平如叶片状，固定时易卷缩用薄荷冰/水合氯醛于7%生理盐水麻醉(2)吸虫整体封片第五章第一节整体制片法70%Alc虫体70%Alc固定2~12h硼砂洋红液染虫体3~10h70%Alc冲洗常规脱水、透明、封片滤纸载片第五章第一节整体制片法(3)琼脂定位，薮枝虫(或水螅体、卵胚)整体封片水螅材料特点：易收缩、需要定位薄荷冰麻醉10%甲醛固定稀释的苏木精/硼砂洋红染色酸酒精分色用琼脂定位于载片上常规脱水、透明、封片第一节薮枝虫第五章第一节整体制片法聚缩虫第二节涂片法

将一些不需切片的动植物的组织细胞或体液组织（如动物的血液、精液、骨髓等）用机械的方法使其均匀地摊在载片上，再进行固定、染色、观察。对玻片要求严格洗液12h~24h流水冲至中性95%Alc第五章重铬酸钾20g，蒸馏水40mL，加热溶解，稍冷，加浓硫酸350mL

一、人血液涂片BloodSmear2.涂片方法：1.取血：第二节涂片法第五章

注意：滴血后马上涂片推片速度、角度大小与血膜厚薄有关一张载片只能涂1次用来推片的载片边缘只能用1次①血滴于一端1/3处30-40°用力均匀、匀速血涂片自然晾干②③④⑤（1）Wright染色法:（2）Giemsa染色法瑞氏粉含曙红和亚甲蓝吉氏粉含曙红和天青对酸碱敏感！天青加热会消失！第二节涂片法第五章3.染色瑞士粉0.1g，甲醇50mL，充分溶解。将染色液滴加到血膜上，染1~3min，再滴加等量蒸流水染2~8min，蒸馏水冲洗，干燥后封片吉士粉0.38g，甘油12.5mL，甲醇37.5mL。甲醇和甘油60℃，配制成吉姆萨原液。使用时0.3mL加蒸馏水10mL。血液涂片用甲醇固定5~10min，染液染15~30min，重蒸水或PBS洗示血涂片不同部位的染色效果人血涂片染色结果12345嗜中性白细胞

小淋巴细胞

嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞单核细胞蟾蜍血鸟血鱼血抗凝剂第二节涂片法第五章二、对虾血淋巴涂片1、血淋巴的采集采血部位的选择：心脏或血窦一次性大量采血或做某些理化性质分析时从心脏取血。要保持虾的活性从血窦取血。据对虾体长选7~9号注射头Wright-Giemsa双染色4%甲醛溶液固定1min50%甲醇溶液固定1min第二节涂片法第五章二、对虾血淋巴涂片

注意：血窦采血的部位应一致血窦采血，采血量不能过大大量采血时，在第1次抽血后停1min，再抽1次。中国对虾血涂片，Giemsa染色第二节第二节涂片法第五章三、贝类血淋巴涂片（补充）1、血淋巴的采集：闭壳肌注射器中加抗凝剂或固定液Baker’甲醛钙;0.05mol/LTris-HCl缓冲液;EM（电镜）(含2%多聚甲醛，2.5%戊二醛，2%NaCl,2mmol/L氯化钙，用0.2mol/L二甲砷酸钠缓冲液配制，pH7.4)，按1：1抽取血淋巴;Alsever’s液3：1抽取血淋巴。第二节Wright-Giemsa染色酶染色密度梯度分离流式细胞仪分类血细胞第二节涂片法第五章第二节涂片法第五章四、刺参体腔液（体腔细胞）涂片（补充）体腔液的采集：从身体腹面或右侧用注射器抽取体腔液注射器（25号针头）中吸入等体积抗凝剂或固定液EM固定液；柠檬酸钠：3.8mg／mL肝素钠：0.2-0.6mg／mL草酸钠：1.0-1.5mg／mL刺参体腔细胞：小淋巴细胞、吞噬细胞、桑葚细胞和结晶细胞等第三节分离法（自学）借药物的作用，使组织软化、组织各组成部分之间的某些结合物质溶解，或用机械的方法，将组织的各个组成部分分离，并使其摊开于玻片上，制成临时或永久性封片。

如：肌肉纤维或神经纤维分离第五章Lumbo-sacralcordTerminalthreadAtechniqueyouknowfromusinganeedletoseparateouttheconnective-tissuefilumterminalefromthenervouscauda

equinaofdorsal&ventralrootsOntheMICROSCOPESLIDE,withaneedlepointonecanteaseapartindividualnerveormusclefibersfromtheirbundlesinnerveormuscle(Filumterminale)第四节铺片法（自学）Spread如：皮下结缔组织制片法

第五章活体染色和铺片C.T.铺片，VerhoeffVanGieson,ToluidineBlue

第五节滴片法以滴片法制作鱼类或贝类等的染色体标本。第五章×PHA秋水仙素第五节滴片法第五章PHA刺激48~72小时原理：

外周血小淋巴细胞，通常都处在G1期（或G0期），一般情况下不进行分裂。若在培养液中加入植物血球凝集素（PHA），小淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。短期培养后，经秋水仙素处理，低渗和固定，即可得到大量的有丝分裂细胞。注射PHA（植物细胞凝集素）或酵母液注射秋水仙素低渗固定滴片第五节滴片法第五章染色体制片材料的选择：

分裂程度高

细胞易于分散

含较少的间质和其它嗜碱性物质染色体标本制备程序：一、鱼类染色体标本的制备第五节滴片法第五章胚胎(卵裂期或原肠期)，上皮细胞，鳃细胞，肾（头肾)细胞

1、材料选择：注射部位杀死鱼前8~10h或16~18h,

PHA(8~10μg/g鱼体重)或酵母液(0.2~0.5ml/100g鱼体重)

杀死鱼前4~5h，秋水仙素(3~5μg/g鱼体重)取头肾,制备细胞悬液

0.075mol/LKCl，低渗

加固定液静置20~30min，重复2-3次

冷滴片Giemsa染色第五节滴片法第五章第五节滴片法第五章二、贝类染色体的制作材料选择：卵胚、幼体（囊胚期~担轮幼虫期）、鳃、生殖细胞（4~8细胞期卵胚）4细胞出现后10~25min，每隔5min处理一批（0.03~0.04%秋水仙素，30min）低渗：25%海水，35℃，30min热滴片固定：1：1醋酸甲醇，1：3醋酸甲醇染色皱纹盘鲍7%MgSO4或MgCl2麻醉后取鳃活体解剖取鳃50%海水配制的0.04%秋水仙素，30min低渗:25%海水，30min固定：carnoy氏液将鳃放入50%冰醋酸解离，细胞浓度（50~150）104个/ml热滴片Giemsa染色三、对虾染色体制片第五节滴片法第五章材料选择:胚胎和幼体；幼虾；成虾时期选精巢、中肠、触角腺或鳃

原肠期至肢芽期胚胎无节幼体0.02%秋水仙素（海水配)雄虾注射秋水仙素（1.5μg/g虾体重),4-6h后取精巢低渗0.3%柠檬酸钠50%海水低渗20min,0.075mol/LKCl10-20min0.075mol/LKCl固定滴片50%醋酸解离材料：主要选择分裂旺盛期的组织如：棘皮动物的胚胎、幼虫，成体的鳃、性腺等，海参采用后期幼虫、耳状幼虫、成体呼吸树组织等四、棘皮动物染色体标本的制备（补充）第五节滴片法第五章5.固定液及固定时间

总结：影响染色体