PCR法获取目的基因演示文稿

PCR法获取目的基因演示文稿目前一页\总数二十一页\编于十五点PCR技术的定义及其发展历史PCR技术的原理PCR的反应体系和条件PCR法获取目的基因PCR技术的未来展望目前二页\总数二十一页\编于十五点PCR技术多聚酶链式反应

(PolymeraseChainReaction)

PCR技术即多聚酶链式反应，又称聚合酶链式反应。是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。

在生物学实验中做为基础存在，可以说是现代分子生物学研究中最重要的技术。

目前三页\总数二十一页\编于十五点一、PCR技术的创建1.Khorana等1971年提出在体外经DNA变性、与适当引物杂交、再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。2.1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。3.1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。

4.1988年，第一台PCR仪问世。5.1989年美国《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。目前四页\总数二十一页\编于十五点二、PCR技术的原理

1.PCR技术在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧核苷酸,耐热性DNA聚合酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的循环合成DNA，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍。一般样品经过30次循环,可使基因的拷贝数达到数百万。目前五页\总数二十一页\编于十五点PCR原理

（1）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物的存在

（3）重复“变性--退火--延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。（2）PCR过程：由变性—复性（退火）--延伸三个基本反应步骤构成①变性：94℃左右，使双链DNA模板解离成为单链；②复性：55℃左右，引物与模板DNA单链互补配对结合；③延伸：72℃左右，“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的DNA链目前六页\总数二十一页\编于十五点2.PCR技术的特点1）速度快，灵敏度高：经过30轮循环，理论上目的产物的扩增量达230个拷贝（109拷贝）。2）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键；引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。3）操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。目前七页\总数二十一页\编于十五点三、PCR的反应体系和基本步骤H2O

35μL10×PCR反应缓冲液

5μL25mmol/LMgCl2

4μL4种dNTP

4μL上游引物（引物１）

0.5μL下游引物（引物２）

0.5μL模板DNA

(约1ng)

0.5μLTaq酶0.5μL

1.反应体系组成成分（总体积：50L）目前八页\总数二十一页\编于十五点模板DNAdNTP引物BufferMg2+预变性模板DNAdNTP引物BufferMg2+TaqDNA聚合酶94℃5min2.基本程序PCR排管目前九页\总数二十一页\编于十五点Taq酶模板DNAdNTP引物BufferMg2+

循环仪94℃55℃72℃72℃5～7min循环25～35次扩增出的目标基因目前十页\总数二十一页\编于十五点琼脂糖凝胶电泳转移点样进行电泳扩增出的目的基因目前十一页\总数二十一页\编于十五点3.PCR反应条件循环参数（1）预变性：94℃5min（2）变性：94℃20s-45s使双链DNA解链为单链（3）退火：温度由引物的解链温度Tm决定，时间45s左右。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度可增加反应的灵敏性。（4）延伸：一般为72℃，时间由扩增片段长度决定。（5）循环次数：主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次次数过多，导致扩增效率降低，错误掺入率增加。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。（6）延伸补齐：72℃5min—10min目前十二页\总数二十一页\编于十五点PCR技术的注意事项1.合理分隔实验室将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其他步骤严格分开。2.吸样枪由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。3.试剂分装所有的PCR试剂都应小量分装，-20℃保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂和PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存。4.防止操作人员污染一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。目前十三页\总数二十一页\编于十五点四、PCR法获取目的基因目前十四页\总数二十一页\编于十五点由TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为TaqDNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时可以使用T载体克隆目的基因。1.T载体克隆PCR获取的目的基因目前十五页\总数二十一页\编于十五点具有3‘-5’外切酶活性的DNA聚合酶（如pfu聚合酶），其扩增的PCR产物是平末端,要对这种平末端的PCR产物进行克隆,应首先对PCR产物的3‘末端进行加A的工作。工作程序如下方案一胶回收平末端PCR产物，进入5µl10×TagDNAPolymeraseBuffer、4种dNTP或dATP（终浓度为200nM）、2.5UTagDNAPolymerase，加水至终反应体积为50µl，72℃保温10min，纯化PCR片段后进行TA克隆方案二PCR反应（50µl反应体积）结束以后，加入1µl20mMdATP和2.5U的Tag酶，72℃保温10min，然后进行直接进行TA克隆目前十六页\总数二十一页\编于十五点2.设计酶切位点克隆PCR获取的目的基因3’5’限制性内切酶的识别序列目的基因的PCR片段3’5’限制性内切酶的识别序列经限制酶切割得到的具有粘性末端的线性载体经限制酶切割得到粘性末端体外连接获得目的基因的克隆目前十七页\总数二十一页\编于十五点1、不对称PCR2、反向PCR(reversePCR)3、多重PCR（复合PCR）4、LP-PCR（Labelledprimers)5、锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）6、PCR固相分析法7、原位PCR8、反转录PCR（RT-PCR)9、

荧光定量PCR（real-timePCR)

五、PCR的类型目前十八页\总数二十一页\编于十五点荧光定位PCR技术（FQ-PCR）FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5′→3′外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5′端标以荧光报告基团，靠近3′端标以荧光淬灭基团，两者之间构成能量传递结构。当PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物是一对一的关系，因此用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号,实现了仪器实时检测，为新的PCR定量原理创造了条件。目前十九页\总数二十一页\编于十五点PCR技术的应用举例：研究：基因克隆；DNA测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与调控蛋白质结合DNA序列；转座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；人类基因组工程：用散布重复序列产生DNA标志；遗传图谱的构建(检测DNA、多态性或精子绘图)；物理图谱的构建；测序，表达图谱法医：犯罪现场标本分析，DNA检测比对，DNA安保标记。医疗：肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤等癌症的筛查。

组织和群体生物学：遗传聚类研究；动物保护研究。

古生物学：考古与博物馆标