第三章生物材料的预处理细胞破碎和液固分离

第三章生物材料的预处理、细胞破碎和液-固分离第一节生物材料的预处理第二节细胞破碎第三节液-固分离

生物活性物质的存在特点（1）生物材料组成非常复杂，有些化合物在生物材料中含量极微，分离操作步骤多，不易获得高收率。（2）生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能关系比较复杂，生物活性物质离开生物体后，易变性，破坏，必须十分小心的保护这些化合物的生理活性。（3）操作过程中受到影响因素多第一节生物材料的预处理一、预处理的目的和要求

生物材料中的生化组成数量大、种类多，目的物与杂质的理化性质十分接近，分离纯化较困难目的——改变料液的流变特性，以及除去对后面纯化有影响的杂质

要求——防止目的物的失活根据生物活性物质存在方式与特点—胞外：由细胞产生再释放出来的无活性的酶原需活化：先活化再提取先提取再活化二、确定预处理方法的依据—胞内：需先破碎细胞后提取膜上的需先溶解下来2.后续操作的要求一般要求：澄清、pH、一定的浓度不同后续操作有不同的要求离子交换---高价无机离子、澄清度等严格控制溶剂萃取---蛋白质含量较低，防乳化3.目的物稳定性不稳定的：要防失活青霉素---pH4.8-5.2，低温蛋白类---高级结构稳定的：可采用较剧烈的变性和处理条件，沉淀杂质蛋白三、动物材料的预处理绞肉机绞碎匀浆和组织捣碎四、细胞培养液的预处理为什么需要预处理？可溶性粘胶状物质：杂蛋白、不溶性多糖等粘度增加、影响提取操作无机盐在采用离子交换提取时，会影响树脂对生化物质的交换容量。（1）加入凝聚剂凝聚作用：指在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。1.细胞及蛋白质的处理胶体粒子稳定的原因：带同种电荷静电排斥作用表面水化作用，形成水化层无机盐促凝聚作用：加入相反电性电解质，中和胶体表面电荷，降低了双电层的排斥力无机盐在水中的水化作用，破坏了胶粒水化层影响凝聚作用的主要因素有无机盐的种类、化合价以及无机盐的用量等。通常培养液中细胞或菌体带负电荷，常采用高价阳离子促其凝固。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+常用的凝聚剂有：Al2(SO4)3·18H2O、AlCl3·6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等。

（2）加入絮凝剂絮凝剂：有机高分子，易溶，链长，活性功能基团多絮凝作用：当往胶体悬浮液中加入絮凝剂时，胶粒可强烈吸附在絮凝剂表面的功能团上，而且一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的颗粒的表面上，形成架桥联接，形成粗大的絮凝团沉淀出来，有助于过滤。影响因素：

分子量：大，效果好；过大，溶解度↓用量：低浓度增加用量有助架桥，浓度过高吸附饱和失去架桥作用，降低了效果。pH：影响功能团电离度，电离度↑，链伸展，效果↑操作条件：搅拌：初期，快好；后期，会破坏絮凝团（3）变性作用天然蛋白质分子受到某些物理因素（如热、紫外线照射、高压和表面张力等）、化学因素（如有机溶剂、脲、胍、酸、碱等）影响时，生物活性丧失，溶解度降低，不对称性增高以及其他的物理化学常数发生改变。用途：杂蛋白质变性沉淀析出方法：加热、大幅度改变pH，加有机溶剂、重金属盐或表面活性剂（4）吸狠附方法奇：—加入赠吸附押剂：贸活性贷碳除绝热原—加入程反应描剂：相姐互作局用形港成沉栏淀吸会附蛋拜白质四环蜡素发故酵液覆：黄李血盐+硫酸期锌飞亚效铁氰榨化锌防钾K2Zn3[F永e(庸CN小)6]2的胶舰状沉裙淀，能将礼杂蛋猛白质拾和菌抛体等档黏附摔在其施中而有除去尝。枯草丧杆菌住的碱培性蛋瞒白酶银发酵旋液：氯化勤钙+磷酸费盐关磷雹酸钙椒盐沉青淀（轻吸附策、助五滤）（5）等黄电沉健淀—常与耽其他池方法稀合用（6）加奴各种姿沉淀晨剂沉兽淀—沉淀熟剂与俱蛋白演质形概成复秩合物窑沉淀2.多糖械的去嫁除酶：转化熔为单陡糖如发友酵液惊中残佳留的以淀粉军：淀可粉酶粘多醒糖与统一些丑阳离址子表厦面活括性剂如十晒六烷已基溴沈化铵画（CT炭AB）形成宫沉淀Ca2+——草酸授、草酸刺钠→形扔成草信酸钙双沉淀（注感意回听收草唤酸）Mg2+——三聚映磷酸朵钠(N榆a5P3P10)→形成弱三聚彻磷酸挺钠镁险可溶洲性络遥合物Fe2+——黄血蝇盐(K雨4F县e(梅CN匠)6欣)→普鲁棍士蓝脏沉淀Ca2＋，Mg2＋，Fe3＋等（1）离赴子交剧换法（2）沉票淀法3.高价兄金属忧离子翅的去指除微生算物细煌胞和刑植物烂细胞轰外层与均为旷细胞楼壁，时细胞阵壁里歼面是讨细胞疏膜动物酷细胞办没有资细胞商壁，灿仅有欧细胞莫膜。通常上细胞本壁较何坚韧禽，细伸胞膜播脆弱脑，易毁受渗艰透压馋冲击牵而破显碎，茄因此代细胞温破碎蚕的阻赔力主毯要来冷自于嚼细胞里壁。第二河节每细年胞破切碎一、机械圣法1、匀掠浆法2、珠迈磨法3、超纽奉声波三、化学呀法1.化学亲试剂2.制成删丙酮散粉二、物理温法1.干燥2.冻融3.渗透定压冲俱击四、生物例法1.酶解袜法2.自溶一、汽机械父法1高压婚匀浆并法定义—利用昏高压性细胞膨悬浮打液因置减压轮所产牛生的滩剪切仓力而职达到企细胞秘破碎贩的过场程工作含原理怖：液疏－液窑剪切遥力、色压力趁差等特点无：适用董对象剃广工业衣化、抛实验颂室中毯应用细胞穴完全艘破碎1.高压萝匀浆丑器原理泳：进赤入高返压室次的细徐胞悬服浮液诱被强苗迫通守过一心个狭遗窄的裹小孔津，产巧生液讽相剪鱼切力响引起饱细胞崖破碎始。易造柱成堵清塞的正团状饭或丝毒状真未菌，较小皮的革游兰氏株阳性浅菌，含有航包含眨体的查基因井工程撞菌（今因包服含体配坚硬矮，易郑损伤扣匀浆巴阀）不宜不采用旷高压炮匀浆叠法的火微生后物：2高速搭珠磨绍法定义—利用教由高鸭速转揭动的翅珠子似所产择生的吊剪切辨力而雕达到牙细胞之破碎放的过固程工作性原理置：固云－固浆剪切湾力、裕液－侮固剪犁切力劫等特点签：适用孔对象词较广工业付化、幅实验阀室中疼应用细胞蓄完全慰破碎需冷渔却2.高速柱珠磨辰机原理回：玻暖璃小纠珠与谊细胞霜悬液散一起宅快速策搅拌单，研嚼磨作扮用，麻细胞辆破碎丈。WS箩K卧式弊高效巧全能秒珠磨蛇机ZM系列卧式涨密闭衫珠(砂)磨机3超声船波法定义—利用右超频增率声都波（15惰-2取5k魄Hz）在近液体意介质抄中传面播所略产生桌的剪浮切力危而达博到细怎胞破撇碎的凉过程工作获原理教：空绢穴现请象特点匠：适用底对象霸一般主要闲于实同验室停中应鞠用细胞辉完全私破碎需冷包却，尿噪音3.超声显波振壤荡器原理消：利箭用超依声波零的空冷穴作娱用，规空穴凑的形续成、贱增大郑和闭枕合产讲生极软大的柱冲击阴波和茎剪切分力，涉使细节胞破榜碎。影响刚因素妄：超振声波北的声酷强、踢频率挤、破申碎时绑间、持介质糖的离炒子强距度、pH、菌困体的躁浓度尖和种太类。一般环杆菌床比球阿菌易旺破碎腾，G-细菌甚比G+细菌棉易破曲碎，夜对酵坡母菌配的效葛果较昆差。朽超声围破碎艳时细律胞浓傅度一怪般在20％左尿右。超声场波破羡碎法闲在实吉验室静和小厨规模论生产碧中应软用较庸广。趟操作至时常秋应把感悬浮领液预乔先冷垂却到0～5℃，并语且还乎应在克夹套颜中连籍续通国入冷格却剂辣进行寇冷却稍。二、抽物理寸法1.干燥库法原理大：干饼燥后肝，细萍胞膜睡渗透经性变锈化，长部分炎菌体袍自溶终，溶肺剂抽呢提得断胞内疏物质留。分类:空气职干燥巴，真空缸干燥猫，喷奥雾干鲁燥，县冷冻把干燥气流康干燥主要展适用艇于酵莲母菌，一般侍在25～30斥℃的气然流中画吹干海；真空饱干燥多用填于细记菌；冷乐冻干福燥适用盏于较谅不稳哄定的戒物质。2.反复兴冻融悉法将细叼胞放糠在低陕温下抚冷冻餐（约-1户5℃），焰然后符在室鸭温中辈融化眼，反负复多唐次而辽达到勉破壁盐作用象。原理武：细胞割膜疏怨水键时结构剖破裂野，增匪加细潮胞亲刊水性冰晶肿粒使旅细胞爬破裂适用鹊于细岂胞壁喉较脆阴弱的遗菌体轧，破俊碎率袭较低障，需羡反复土多次训，此违外，僚在冻规融过您程中劫可能猾引起限某些者蛋白蜻质变唇性。3.渗透阁压冲鞭击法原理列：细胞跟在浓必盐中扮平衡挣，再读投入殊水中她膨胀教破裂埋。三、恨化学帆法1.加入逗化学酱试剂采用滚化学浅法处司理可家以溶浑解细辽胞或侍抽提怜胞内嫩组分深。碱：货溶解趋除细张胞壁嘴外大考部分判组分衔，改傻变pH，改撞变蛋气白质削的电腐荷性垦质有机徐溶剂拔：溶驳解细抗胞膜薄上脂注质，秒破坏欲细胞掘，但费易引殖起变富性表面标活性着剂：念改变疾膜的集通透促性，类细胞心溶解胞内文异淀问粉酶积：0.见1%梳SD碍S，30崖℃振荡30刘h2.丙酮无粉保存+破碎脱水必脱脂刻，细瓜胞结盼构松淋散方法器：组织歌或匀顺浆悬范浮0.脾01肉mo击l/甜Lp洞H6苦.5的磷旺酸缓您冲溶伤液中识，0℃一边冬搅拌倚，一顽边徐核徐倒营入10倍体瞧积的-1锹5谈℃丙酮围内，10撕mi绝n后离摄心过过滤取庙其沉耳淀，游反复埋用冷上丙酮桂洗几它次，唐真空截干燥狸得。四、镜生物防法1.酶解掩法：机理歉：利规用酶睁反应西分解适破坏滔细胞嫌壁上础特殊胞的化练学键常用佣的溶航酶G+溶菌都酶G-溶菌狗酶、ED腰TA放线编菌义溶菌幅酶酵母善菌β-葡聚倒糖酶霉菌柳几犯丁质愈酶、植物女纤度维素们酶、与半纤框维素损酶细胞侍壁溶液解酶例是几侧种酶脸的复恢合物-加入城酶：简溶菌情酶、孟蛋白料酶、喜脂肪敏酶、胶核酸塌酶等酶解肺法的纸优点发生墨酶解型的条百件温猫和能选江择性恼地释基放产助物胞内始核酸糟等泄贞出量捆少，荡细胞只外形底较完甜整，差便于漆后步撇分离多等但酶滥水解护价格史高，支故小凡规模毫应用栋较广2.自溶绕：诱发走微生糊物产伤生过帐剩的傅溶胞鹿酶或遍激发滥自身和溶胞触酶的后活力阻，以奸达到级细胞鼻自溶鸡的目忠的。微生坐物细夜胞的狱自溶防常采磁用加纲热法狡和干晋燥法违。酵母话细胞甘：45～50森℃，12压-2皮4h1.规模即及成逆本大规乱模：泻高压梢匀浆兄、珠块磨实验宵室规虾模：贵超声炒波振刷荡2.目的床物的遥稳定显性干燥疤法、页有机侧溶剂龟对活您性影叙响大保护仔性措布施3.破碎侄效果改和产帆物释笑放率动物予细胞粥：渗笛透压姐冲击丑、冻贿融法微生第物细女胞：袖结合伪酶法高释现放率械又不晨能使罚细胞叨碎片介太小适宜最的操客作条慢件应还从高的璃产物过释放继率、低的纪能耗和便于醋后步橡提取这三篇方面崭权衡摇。五、睁选择刃破碎甜方法备的依邀据机械时法与剥非机鹊械法救破碎揭的比竿较项目机械法非机械法机理切碎细胞溶解局部壁膜内含物释放全部部分（有选择）碎片大小细小较大粘度高低设备专用无应用范围工业化、实验实验研究第三坟节液－干固分冬离过滤定义——在一总定的萄压力摊差下蚕，将卧固液谋悬浮团液通欧过一胜多孔窜性介往质而分实现环固液万分离宗的过封程原理——筛分过滤屿类型——常规愁过滤坦、错先流过哭滤常规址过滤孙：料欲液流喘动方丢向和跟过滤互介质办垂直错流泼过滤猾：滤奴液给绒过滤弓介质闸表面膨一个泻平行揭的大吉流量冲阴刷，驳多用暂薄而手多孔占的膜优点壳：收张率高妖，质夺量好凉，减喊少处偷理步诉骤—错流披过滤鸡：料液蹦与过酿滤介蔬质表开面平反行的斩大流达量冲纹刷过滤退收率猎高滤液举质量睬好减少疑处理捧步骤2.过滤世设备板框旷过滤惩机真空父鼓式私过滤代机3.过滤惑介质吼和助量滤剂（1）过朽滤介腔质滤布筹或膜耐酸兄碱、酱高温死、化寺学试牙剂、半抗拉界性能背好、牙有一锻定的滑机械记强度尤和孔掘隙度僻等（2）助抄滤剂要求处为惰伸性物谋质、凤无毒查、有萌一定阻细度筛及硬旅度，拿成本柱低廉期。加入盏方法撤：—预铺疮法：企预铺私在过意滤机贪上—混合文法：且与发跟酵液维一起界加入—生成恭法：饶反应硬中生吃成沉批淀新生再霉素缸发酵筑液：常用献有：喝硅藻营土、认纸浆似、石怒棉、脆纤维摔素等二.离心锐分离定义——在离烟心场新作用殿下，绳料液丽中固汤体依军据其摊与介胃质密霜度的误不同土达到鼓固液胁分离蓝的过悟程原理——密度偶差类型——沉降得式、废过滤兽式离心纠设备——管式第、套侦筒式瞎、碟骆式、邀篮式就等优点宵：速