实验三农杆菌感受态细胞制备及转化

实验三、农杆菌感受态细胞制备及转化王欢欢二零一二.十植物基因工程实验技术OD值与细菌生长曲线I.调整期（lagphase）II.对数期(logarithmicphase)III.稳定期（stationaryphase）IV.衰亡期（declinephase）在对数生长期，OD值可以代表菌体密度，细菌悬液浓度与光密度成正比，可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液浓度。但当生长到一定时间后，OD值不会再增加.农杆菌介导基因转化农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。

根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。特点：操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。农杆菌感受态感受态细胞（competentcell)是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态.重组DNA要导入宿主细胞，其生理状态很重要，需要将细胞进行特殊处理，使细胞膜透性发生暂时性改变，成为容易接受外源DNA分子的状态，即成为感受态细胞。电击法，CaCl2法。不同的转化方法需制备不同的感受态。CaCl2法制备感受态：正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态.农杆菌感受态的制备A挑取农杆菌单菌落于液体培养基中，28°C，200rpm振荡培养过夜活化B菌液按1:50的比例转接于50ml新鲜培养基中，振荡培养至OD600为0.4-0.6；C菌液转移至10ml的离心管中，冰浴30minD4℃，5000rpm离心5min,弃上清，收集菌体E菌体重悬于4ml冰预冷的20mM的CaCl2中，冰浴10-20minF4℃，5000rpm离心5min，弃上清G菌体重悬于1ml冰预冷的20mM的CaCl2，分装100µl/管，24h内使用或液氮速冻后-70°C保存感受态制备的要点：

OD600：0.4～0.6OD值超过0.6必须重新活化当OD达到0.3时，每隔20min测一次OD值。分光光度计要测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态，有沉淀要摇匀。注意比色杯的正确选择及使用光电比色法定量测试原理：朗伯比尔定律：“当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比”。其中“吸收层厚度”就是实践中的比色杯厚度，如果测试中使用的比色杯不是同一套，就无法保证其厚度一致，也就人为导致测试结果出现偏差。玻璃比色杯只适用于可见光区,在紫外区测定时要用石英比色杯。石英玻璃在紫外线到红外线的整个光谱波段都有较好的透光性能，可见光透过率在９３％以上，特别是在紫外光谱区，最大透过率可达８０以上，而普通的玻璃在紫外光谱区的透过率较差。一般，测定波长在350毫微米以上时，可以用玻璃比色杯；若在350毫微米以下，必需使用石英比色杯。农杆菌的转化取100µL农杆菌感受态，加入约0.5-1µg质粒DNA,混匀后冰浴30min液氮中速冻1min,迅速置于37℃水浴中5min加入1mLYEP培养基，28℃慢摇培养2-4h离心去上清，将细胞重悬于200µLYEP培养基中均匀涂布在含Rif和Kan的YEP平板上，28°C温育48h至菌落出现载体分子带有抗生素抗性基因（kan），感受态受体细胞本身不具有抗生素的抗性，没有导入载体的细胞在抗生素培养基上便不能生长。感受态细胞制备及转化中出现的问题感受态转化效率关键是菌液OD值的控制。转化效率的关键是感受态细胞的活性以及外载体分子的质量，质粒/连接产物。用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化效率将会降低。防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所有的试剂都要灭菌感受态细胞制备及转化中出现的问题感受态长期保存要进行速冻，立即用-80℃冰箱或液氮速冻，而在使用时，用37℃水浴或手掌体温进行速融，避免冰晶形成过程对细胞造成的伤害，导