慢性乙型肝炎不同脾虚兼证与外周血树突状细胞表型及功能的关系

慢性乙型肝炎不同脾虚兼证与外周血树突状细胞表型及功能的关系【摘要】目的：研究慢性乙型肝炎患者不同脾虚兼证与外周血树突状细胞表型及功能的关系。方法：CHB患者60例，按中医证候诊断标准分为脾虚肝郁、脾虚湿热和脾肾两虚组，每组20例，10名健康人为正常对照。分离各组外周血单个核细胞，体外诱导培养DC，流式细胞仪测定DC表型，酶联免疫吸附检测法测定DC分泌白细胞介素10浓度，同步检测患者生化指标及乙肝病毒的脱氧核糖核酸水平。结果：CHB患者DC体外诱导增殖能力较正常人下降，DC成熟表面标记物显着低于正常人。不同证候CHB患者DC表面标记物CD80、CD86和CD1a表达阳性率均低于正常人。脾虚肝郁证患者CD80、CD1a和HLADR表达阳性率显着高于脾肾两虚证，脾虚湿热证患者CD1a表达阳性率显着高于脾肾两虚证。CHB患者DC培养上清中IL10浓度显着高于正常人。脾肾两虚证患者DC培养上清中IL10含量高于脾虚肝郁证。结论：在CHB发病过程中，不同脾虚兼证CHB患者DC的表型及功能间存在差异，提示中医证候分类与机体免疫功能之间存在一定相关性。

【关键词】慢性乙型肝炎;树突状细胞;中医学;脾虚;证候

Objective:Tostudythephenotypesandfunctionsofdendriticcells(DCs)derivedfromperipheralbloodmonocytesofchronichepatitisB(CHB)patientswithdifferenttraditionalChinesemedicine(TCM)syndrometypes,andtoexploretherelationshipbetweenTCMsyndrometypeandDCfunctions.

Methods:SixtyCHBpatientswereincludedinthisstudy.AlltheCHBpatientsweredividedintospleendeficiencyandliverstagnation,spleendeficiencyanddampnessheatanddeficiencyofbothspleenandkidneygroupsaccordingtoTCMsyndromediagnosisstandard.Therewere20casesineachgroup,andtenhealthypeoplewereincludedasnormalcontrol.Thevolunteer’speripheralbloodwascollectedformonocyteseparation,biochemicaltestandhepatitisBvirusDNAloadsdetection.DCswereinducedandisolatedfromperipheralbloodmonocytes,andthentheexpressionsofsurfacemarkersCD80,CD86,CD1aandHLADRweredetectedbyflowcytometricanalysismethod.Interleukin10(IL10)productionoftheDCswasquantifiedbyenzymelinkedimmunosorbentassay.

Results:TheproliferationofDCsintheCHBpatientswasslowerthanthatinthehealthyvolunteers().TheexpressionsofDCsurfacemoleculessuchasCD80,CD86,andCD1awereobviouslydecreasedintheCHBpatientsascomparedwiththoseinthehealthyvolunteers().Moreover,expressionsofDCsurfacemoleculesweredifferentamongCHBpatientswithdifferentTCMsyndrometypes.ThepositiveexpressionsofCD80,CD1a,andHLADRintheCHBpatientswithspleendeficiencyandliverstagnationwereobviouslyhigherthanthoseintheCHBpatientswithdeficiencyofbothspleenandkidney(),andtheCD1aexpressionintheCHBpatientswithspleendeficiencyanddampnessheatwashigherthanthatintheCHBpatientswithdeficiencyofbothspleenandkidney().InDCculturesupernatant,theIL10concentrationoftheCHBpatientswithdeficiencyofbothspleenandkidneywashigherthanthatoftheCHBpatientswithspleendeficiencyandliverstagnation(),andtheIL10concentrationsoftheCHBpatientswithdifferentTCMsyndrometypeswerehigherthanthatofthehealthyvolunteers().

Conclusion:DuringthepathogeniccourseofCHB,thephenotypesandfunctionsofDCsaredifferentinCHBpatientswithdifferentTCMsyndrometypes.ItsuggeststhatthereisacorrelationbetweenTCMsyndrometypeandbodyimmunityfunction.

Keywords:chronichepatitisB;dendriticcell;traditionalChinesemedicine;spleendeficiency;syndrome

外周血树突状细胞是人体内功能最强的抗原提呈细胞，其功能状态直接影响细胞和体液免疫应答。研究显示慢性乙型肝炎患者存在不同程度的免疫耐受［1,2］，特别是存在树突状细胞功能缺陷，而健脾类中药可改善CHB患者树突状细胞功能，提高机体免疫功能［3］。以脾虚为主的不同中医证候分类之间可能存在DC活性的差别，本研究旨在研究CHB不同中医证候分类患者DC表型及功能差异，探讨DC成熟障碍的证候生物学特点。

1资料与方法

临床资料

研究对象健康志愿者10名，为上海中医药大学龙华医院职工。CHB患者60例，来自上海中医药大学龙华医院肝科2008年6～12月门诊患者。其中男37例，年龄19～60岁，平均岁，病程2～20年，平均年；女23例，年龄23～59岁，平均岁，病程2～19年，平均年。

诊断标准西医诊断标准参照2000年中华医学会《病毒性肝炎防治方案》［4］标准。中医证候分类标准参照《中药新药临床研究指导原则》［5］及《中医诊断学》5版教材［6］，以临床表现及舌苔脉象为依据制定脾虚肝郁、脾虚湿热和脾肾两虚证候判别标准。入选病例半年内均未接受免疫调节治疗，两周内未接受中药治疗。

研究方法

试剂仪器双抗培养液RPMI1640培养基购自美国Sigma公司；胎牛血清购自兰州民海生物工程有限公司；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4购自美国Peprotech公司；荧光标记CD80FITC、CD86PE、CD1aPECY5和HLADRAPC单克隆抗体购自美国BD公司；白细胞介素10试剂盒购自美国Rapidbio公司；FACSCalibur流式细胞仪为美国BD公司产品。

中医证候判定标准脾虚证：凡具有食少纳呆、体倦乏力、食后腹胀、大便异常等症状任意2项者，即诊断脾虚证。脾虚肝郁证：符合脾虚证诊断，并具有胸胁、少腹胀痛，嗳气、吞酸，情绪抑郁或烦躁易怒，善太息，口干苦或咽部如有物梗阻感等症状任意3项者，即诊断脾虚肝郁证。脾虚湿热证：符合脾虚证诊断，并具有口渴少饮，便溏不爽，肢体困重，身热不扬，舌质红、苔黄腻，脉濡数等症状任意3项者，即诊断脾虚湿热证。脾肾两虚证：符合脾虚证诊断，并具有腰膝酸软、性欲减退、畏寒肢冷、夜尿频多、五心烦热等症状任意2项者，即诊断脾肾两虚证。

肝功能及乙肝病毒脱氧核糖核酸检测丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶和总胆红素检测由上海中医药大学龙华医院检验科完成，乙肝病毒脱氧核糖核酸由上海艾迪康医学检验中心完成。

单个核细胞的分离采集患者外周血10mL，肝素抗凝，密度梯度离心法获取单个核细胞，无血清RPMI1640悬浮沉淀细胞、计数，调整细胞浓度为2×106～6×106/mL，各组均以每孔mL，置于6孔板中，37℃、5%CO2孵箱中温育2h，去除未贴壁细胞，获得单个核细胞。

DC体外定向诱导分化和培养按照Romaru等分离培养DC的方法［7,8］，并稍作修改。单核细胞用无血清RPMI1640清洗3次，加入10%胎牛血清RPMI1640培养液，重组GMCSF100ng/mL和rhIL4100ng/mL终浓度加入细胞因子，37℃、5%CO2培养，隔日半量换液1次法检测DC培养上清液中细胞因子IL10浓度。

统计学方法数据用x±s表示，组间率的比较采用方差分析，两两比较采用最小显着差异法和GameHowell法，用SPSS版软件分析。

2结果

DC形态及增殖外周血获取的PBMC，贴壁培养2h后，获得的贴壁细胞为单核细胞；培养第3天，见贴壁单核细胞聚集成均匀散布的细胞聚体；培养第5天，可见部分细胞成簇、聚集样增生，形态变为轻度不规则形；培养第7天，培养孔中可见大部分细胞悬浮不贴壁，形态不规则，倒置相差显微镜观察可见伸展的大量毛刺。贴壁培养第7天，扫描电子显微镜观察示细胞表面粗糙，有大量皱折和不规则突起形成典型DC形态。DC在体外经细胞因子的刺激可明显增殖，但CHB患者DC的增殖能力较正常人低。

图1不同贴壁培养时间的DC形态

Figure1MorphologyofDCatdifferenttimepointsafteradherentcultivation(Invertedphasecontrastmicroscopy,×200)

A:Twohoursafteradherentcultivation;B:Daythreeafteradherentcultivation;C:Dayfiveafteradherentcultivation;D:Daysevenafteradherentcultivation.

不同中医证候分类CHB患者肝功能及HBVDNA测定不同中医证候分类CHB患者肝功能各指标及HBVDNA载量比较，差异均无统计学意义。见表1。

不同中医证候分类CHB患者DC表型流式细胞检测结果显示，不同中医证候分类CHB患者DC表面分子CD80、CD86、CD1a表达阳性率均低于正常人群，脾虚湿热和脾肾两虚证患者HLADR表达阳性率亦低于正常人；其中，脾虚肝郁证患者CD80、CD1a和HLADR表达阳性率显着高于脾肾两虚证；脾虚湿热证患者CD1a表达阳性率显着高于脾肾两虚证。见表2和图3。【摘要】目的：研究慢性乙型肝炎患者不同脾虚兼证与外周血树突状细胞表型及功能的关系。方法：CHB患者60例，按中医证候诊断标准分为脾虚肝郁、脾虚湿热和脾肾两虚组，每组20例，10名健康人为正常对照。分离各组外周血单个核细胞，体外诱导培养DC，流式细胞仪测定DC表型，酶联免疫吸附检测法测定DC分泌白细胞介素10浓度，同步检测患者生化指标及乙肝病毒的脱氧核糖核酸水平。结果：CHB患者DC体外诱导增殖能力较正常人下降，DC成熟表面标记物显着低于正常人。不同证候CHB患者DC表面标记物CD80、CD86和CD1a表达阳性率均低于正常人。脾虚肝郁证患者CD80、CD1a和HLADR表达阳性率显着高于脾肾两虚证，脾虚湿热证患者CD1a表达阳性率显着高于脾肾两虚证。CHB患者DC培养上清中IL10浓度显着高于正常人。脾肾两虚证患者DC培养上清中IL10含量高于脾虚肝郁证。结论：在CHB发病过程中，不同脾虚兼证CHB患者DC的表型及功能间存在差异，提示中医证候分类与机体免疫功能之间存在一定相关性。

【关键词】慢性乙型肝炎;树突状细胞;中医学;脾虚;证候

Objective:Tostudythephenotypesandfunctionsofdendriticcells(DCs)derivedfromperipheralbloodmonocytesofchronichepatitisB(CHB)patientswithdifferenttraditionalChinesemedicine(TCM)syndrometypes,andtoexploretherelationshipbetweenTCMsyndrometypeandDCfunctions.

Methods:SixtyCHBpatientswereincludedinthisstudy.AlltheCHBpatientsweredividedintospleendeficiencyandliverstagnation,spleendeficiencyanddampnessheatanddeficiencyofbothspleenandkidneygroupsaccordingtoTCMsyndromediagnosisstandard.Therewere20casesineachgroup,andtenhealthypeoplewereincludedasnormalcontrol.Thevolunteer’speripheralbloodwascollectedformonocyteseparation,biochemicaltestandhepatitisBvirusDNAloadsdetection.DCswereinducedandisolatedfromperipheralbloodmonocytes,andthentheexpressionsofsurfacemarkersCD80,CD86,CD1aandHLADRweredetectedbyflowcytometricanalysismethod.Interleukin10(IL10)productionoftheDCswasquantifiedbyenzymelinkedimmunosorbentassay.

Results:TheproliferationofDCsintheCHBpatientswasslowerthanthatinthehealthyvolunteers().TheexpressionsofDCsurfacemoleculessuchasCD80,CD86,andCD1awereobviouslydecreasedintheCHBpatientsascomparedwiththoseinthehealthyvolunteers().Moreover,expressionsofDCsurfacemoleculesweredifferentamongCHBpatientswithdifferentTCMsyndrometypes.ThepositiveexpressionsofCD80,CD1a,andHLADRintheCHBpatientswithspleendeficiencyandliverstagnationwereobviouslyhigherthanthoseintheCHBpatientswithdeficiencyofbothspleenandkidney(),andtheCD1aexpressionintheCHBpatientswithspleendeficiencyanddampnessheatwashigherthanthatintheCHBpatientswithdeficiencyofbothspleenandkidney().InDCculturesupernatant,theIL10concentrationoftheCHBpatientswithdeficiencyofbothspleenandkidneywashigherthanthatoftheCHBpatientswithspleendeficiencyandliverstagnation(),andtheIL10concentrationsoftheCHBpatientswithdifferentTCMsyndrometypeswerehigherthanthatofthehealthyvolunteers().

Conclusion:DuringthepathogeniccourseofCHB,thephenotypesandfunctionsofDCsaredifferentinCHBpatientswithdifferentTCMsyndrometypes.ItsuggeststhatthereisacorrelationbetweenTCMsyndrometypeandbodyimmunityfunction.

Keywords:chronichepatitisB;dendriticcell;traditionalChinesemedicine;spleendeficiency;syndrome

外周血树突状细胞是人体内功能最强的抗原提呈细胞，其功能状态直接影响细胞和体液免疫应答。研究显示慢性乙型肝炎患者存在不同程度的免疫耐受［1,2］，特别是存在树突状细胞功能缺陷，而健脾类中药可改善CHB患者树突状细胞功能，提高机体免疫功能［3］。以脾虚为主的不同中医证候分类之间可能存在DC活性的差别，本研究旨在研究CHB不同中医证候分类患者DC表型及功能差异，探讨DC成熟障碍的证候生物学特点。

1资料与方法

临床资料

研究对象健康志愿者10名，为上海中医药大学龙华医院职工。CHB患者60例，来自上海中医药大学龙华医院肝科2008年6～12月门诊患者。其中男37例，年龄19～60岁，平均岁，病程2～20年，平均年；女23例，年龄23～59岁，平均岁，病程2～19年，平均年。

诊断标准西医诊断标准参照2000年中华医学会《病毒性肝炎防治方案》［4］标准。中医证候分类标准参照《中药新药临床研究指导原则》［5］及《中医诊断学》5版教材［6］，以临床表现及舌苔脉象为依据制定脾虚肝郁、脾虚湿热和脾肾两虚证候判别标准。入选病例半年内均未接受免疫调节治疗，两周内未接受中药治疗。

研究方法

试剂仪器双抗培养液RPMI1640培养基购自美国Sigma公司；胎牛血清购自兰州民海生物工程有限公司；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4购自美国Peprotech公司；荧光标记CD80FITC、CD86PE、CD1aPECY5和HLADRAPC单克隆抗体购自美国BD公司；白细胞介素10试剂盒购自美国Rapidbio公司；FACSCalibur流式细胞仪为美国BD公司产品。

中医证候判定标准脾虚证：凡具有食少纳呆、体倦乏力、食后腹胀、大便异常等症状任意2项者，即诊断脾虚证。脾虚肝郁证：符合脾虚证诊断，并具有胸胁、少腹胀痛，嗳气、吞酸，情绪抑郁或烦躁易怒，善太息，口干苦或咽部如有物梗阻感等症状任意3项者，即诊断脾虚肝郁证。脾虚湿热证：符合脾虚证诊断，并具有口渴少饮，便溏不爽，肢体困重，身热不扬，舌质红、苔黄腻，脉濡数等症状任意3项者，即诊断脾虚湿热证。脾肾两虚证：符合脾虚证诊断，并具有腰膝酸软、性欲减退、畏寒肢冷、夜尿频多、五心烦热等症状任意2项者，即诊断脾肾两虚证。

肝功能及乙肝病毒脱氧核糖核酸检测丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶和总胆红素检测由上海中医药大学龙华医院检验科完成，乙肝病毒脱氧核糖核酸由上海艾迪康医学检验中心完成。

单个核细胞的分离采集患者外周血10mL，肝素抗凝，密度梯度离心法获取单个核细胞，无血清RPMI1640悬浮沉淀细胞、计数，调整细胞浓度为2×106～6×106/mL，各组均以每孔mL，置于6孔板中，37℃、5%CO2孵箱中温育2h，去除未贴壁细胞，获得单个核细胞。