新型人趋化素样因子超家族8对人白血病细胞增殖和表皮生长因子受体表达的影响

新型人趋化素样因子超家族8对人白血病细胞增殖和表皮生长因子受体表达的影响【摘要】本研究探讨新型趋化因子CKLFSF8对人白血病HL60细胞的增殖和表皮生长因子受体表达的影响，应用RTPCR方法检测CKLFSF8基因在HL60细胞中的表达；利用脂质体将CKLFSF8基因转染到HL60细胞，在倒置显微镜下观察细胞生长；MTT法检测细胞的增殖程度；免疫细胞化学法检测CKLFSF8基因转染前后HL60细胞EGFR的表达。结果表明：在细胞生长过程中可检测到CKLFSF8表达；CKLFSF8基因转染前后HL60细胞的增殖受到了明显的抑制，与空白对照组和空质粒组相比有显着性差异；对比转染前后细胞EGFR表达的阳性率具有显着性差异。结论：CKLFSF8基因转染对白血病细胞HL60的增殖和EGFR的表达有明显抑制作用。

【关键词】CKLFSF8；HL60细胞；细胞增殖；EGFR

EffectsofNovelHumanChemokinelikeFactorSuperfamily8onProliferationandEGFRExpressionofHL60Cells

AbstractThisstudywasaimedtoinvestigatetheeffectofchemokinelikefactorsuperfamily8(CKLFSF8)onproliferationandexpressionofepidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)ofHL60cells.ExpressionofCKLFSF8mRNAonHL60celllinewasassayedbyRTPCR;thetargetgenewastransfectedintothecellsbylipidvector,cellproliferationwasdeterminedbyMTTassay,whileexpressionofEGFRinHL60wasdeterminedbyimmunocytochemicaltechnique.TheresultsindicatedthatexpressionofCKLFSF8existedinHL60cells.Aftertransfection,cellproliferationwasinhibited(P﹤)andtheexpressionofEGFRinHL60cellswasalsodiscoveredtobeinhibited(P﹤).ItisconcludedthattheproliferationandexpressionofEGFRinHL60cellscanbeinhibitedbytransfectionofCKLFSF8.Thenovelchemokinemayprovideanewapproachinthetreatmentofleukemia.

KeywordsCKLFSF8;HL60cell;cellproliferation;EGFR

趋化因子是一组具有趋化活性的小分子蛋白质,在炎症、肿瘤、自身免疫性疾病、变态反应及AIDS的演化等过程中发挥重要作用［1］。趋化素样因子超家族成员8(chemokinelikefactorsuperfamily，CKLFSF8)是新近发现的新型人类趋化因子。研究发现，大多数细胞内都有该因子的表达，在肝脏、肺脏和胰腺细胞内高表达；CKLFSF8在某些肿瘤组织和肿瘤细胞中也有表达［2］，但有关CKLFSF8对肿瘤细胞表皮生长因子影响的研究报道尚少。为了探讨这种新的趋化因子在白血病的发生发展中的作用，我们选择白血病细胞株HL60为研究对象，观察新型细胞因子CKLFSF8对HL60的增殖和表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)表达的影响。

材料和方法

菌株和质粒

DH5α购自Gibco公司。带有目的基因片段CKLFSF8的质粒和pEGFP由北京大学人类疾病基因研究中心马大龙教授惠赠。人白血病限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ为TakaRa产品。质粒提取试剂盒为Vegen产品。RPMI1640及TRIZOLRNA提取试剂为Gibco产品。RTPCR试剂为上海生物工程技术有限公司产品。小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品。转染试剂LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品。山羊抗人EGFR抗体为SantaCruz公司产品。免疫组织化学试剂盒为北京中杉生物技术有限公司产品。

HL60细胞的培养和RNA的提取

将HL60细胞接种于含100ml/L小牛血清的RPMI1640培养液，置37℃5%CO2培养箱中常规培养。取生长旺盛的HL60细胞，按TRIZOL试剂盒说明书提取肿瘤细胞总RNA。

HL60细胞CKLFSF8的检测

采用RTPCR法，将HL60细胞总RNA进行反转录。根据CKLFSF8mRNA序列设计引物，上游为3‘GCCTTCATGAGTCAAGGTCGT5‘，下游为5‘AGAGAGGTAGAAGACGAAGGC3‘。PCR反应条件94℃7分钟,94℃30秒,59℃30秒,72℃40秒,72℃7分钟，共进行35个循环。βactin做内对照。10g/L琼脂糖凝胶电泳，观察扩增产物片段。

质粒扩增和鉴定

制备感受态细胞，用质粒－CKLFSF8进行转化，涂在含有氨苄青霉素的培养基上，37℃培养12小时，挑取单个菌落，37℃震摇培养3小时，按质粒提取试剂盒方法提取质粒。将质粒分别进行EcoRⅠ单酶切和EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切。琼脂糖电泳鉴定获得的CKLFSF8基因片段。

CKLFSF8基因转染HL60细胞

按试剂盒使用说明书进行转染。取1×106个处于对数生长期的HL60细胞，用无血清培养基洗2次，用500μl无血清培养基接种于6孔培养板，将2μg带有目的基因片段CKLFSF8的质粒与10μl脂质体混合后缓慢均匀加到细胞表面，孵育5小时后更换2倍血清浓度的完全培养液，培养24小时。更换完全培养液，继续培养48小时收获细胞进行检测。首先以带绿色荧光蛋白的质粒pEGFP－CKLFSF8转染HL60细胞来检测转染率。用荧光显微镜观察转染后绿色荧光蛋白表达的情况，计数10个视野的细胞，取平均值作为转染率。然后分别设未转染质粒的对照组、质粒对照组和－CKLFSF8质粒转染组。

HL60细胞增殖的检测

将200μl105个转染细胞和对照组细胞分别加入96孔细胞培养板，每组3个复孔，37℃5%CO2培养48小时,每孔加入MTT10μl,继续培养4小时。小心吸出培养上清，每孔加入100μl二甲基亚砜，震荡溶解颗粒,用酶标检测仪测定A570值。

CKLFSF8基因转染HL60细胞前后EGFR表达的检测

采用免疫细胞化学方法检测。HL60细胞做细胞滴片，用800ml/L丙酮固定10分钟，pHPBS冲洗，依次在标本片上滴加1∶500稀释的山羊抗人EGFR抗体，用PBS冲洗后，滴加辣根过氧化物酶标记的小鼠抗山羊二抗，DAB显色，光学显微镜下观察，阳性细胞是被染成棕色的细胞，各观察10个视野，计数200个细胞，计算EGFR阳性表达率。

阳性率=(阳性细胞数/细胞总数)×100%

统计学处理

实验所得数据用SPSS软件进行t检验,用均数±标准差(±SD)表示。

结果

CKLFSF8基因在HL60细胞中的表达

白血病细胞株HL60总RNARTPCR结果显示，在100-250bp之间出现单一电泳带。根据所设计引物和GeneBank中CKLFSF8mRNA的序列，扩增产物片段应为187bp，与电泳带符合。这说明CKLFSF8基因在这种细胞中有表达。

Figure1.mRNAexpressionofCKLFSF8inHL60.Lane1:β－actin.Lane2:CKLFSF8fragment.M:markerDL2000.

CKLFSF8质粒的酶切鉴定

质粒CKLFSF8经EcoRI单酶切得到该质粒的全长DNA片段，为6020bp。经EcoRI和BamHI双酶切得到长度分别为5500bp和520bp两个DNA片段，其中520bp片段为CKLFSF8基因。

Figure2.RestrictiveanalysisoftherecombinantplasmidCKLFSF8Lane1:CKLFSF8/EcoRI+BamHI.Lane2:CKLFSF8/EcoRI.M:DNAmarker.

CKLFSF8基因转染对HL60细胞增殖的影响

与空质粒对照组和空白对照组相比CKLFSF8质粒组A570值显着降低，而空质粒组和空白组无显着性差异。这说明CKLFSF8对白血病细胞HL60有明显抑制作用。

Table.EffectofCKLFSF8onproliferationofHL60cells

GroupHL60CKLFSF8±**±*Control±*P﹥comparedwithcontrolgroup；**P﹤comparedwithcontrolgroupand

CKLFSF8基因转染对HL60EGFR表达的影响

荧光显微镜观察转染后绿色荧光蛋白的表达情况，并且经过计算得出脂质体介导的HL60细胞的转染率是％。CKLFSF8质粒转染HL60细胞前后EGFR表达的阳性率比较，转染前阳性率为％，转染后阳性率为％,差异具有统计学意义，说明CKLFSF8对HL60细胞的EGFR表达有抑制作用。

讨论

趋化因子是一组结构相似的小分子蛋白质，在蛋白质水平上含有4个保守的半胱氨酸，根据前2个半胱氨酸的相对位置不同，可分为CXC、CC、C和CX3C4个亚家族，C代表半胱氨酸，X代表任一氨基酸［3］。北京大学人类疾病基因研究中心从人单核细胞的前体细胞株U937细胞中分离出一种新的细胞因子命名为趋化素样因子1(chemokinelikefactor1，CKLF1)［4］，因其氨基酸序列中有3个半胱氨酸，最后2个连续排列，呈CC家族趋化因子的特征性结构，因此将其归为CC家族趋化因子［5］。随后运用生物信息学的方法,又发现与CKLF1有同源性的其它8个基因,分别命名为趋化素样因子超家族成员1-8(chemokinelikefactorsuperfamily1-8，CKLFSF18)［6］。其中，CKLFSF8基因位于第3号染色体，其cDNA全长1185bp，其中第295816位核苷酸编码173个氨基酸组成的CKLFSF8蛋白分子，该蛋白属CKLF1超家族成员，包括4个跨膜区和1个MARVEL结构域，该结构域与TM4SF结构相似，且CKLFSF8与TM4SF有％氨基酸相同［3］。CKLFSF8分子有2个变异体，分别由173和115个氨基酸残基组成。本实验就其中1个变异体即由173个氨基酸残基组成的趋化因子进行了研究。

在本实验中，利用含CKLFSF8的质粒转染HL60细胞，对转染前后细胞株中该因子的表达情况进行观察。结果显示，HL60细胞能表达CKLFSF8，转染CKLFSF8后细胞内CKLFSF8过表达，细胞的增殖明显被抑制，与对照组相比有显着性差异。

表皮生长因子受体是一种位于细胞膜上的酪氨酸激酶受体，其编码基因又称erbB1。EGFR与其配体结合后，通过自身磷酸化介导细胞内一系列的生长信号，促进细胞增殖。同时EGFR还能促进肿瘤部位新生血管的形成，而促进肿瘤的生长和转移［7］。人类的多种肿瘤细胞中也可见EGFR和其配体的高表达［8］。临床研究显示，针对EGFR的药物和单克隆抗体能够抑制肿瘤细胞的增殖［9］。因此，EGFR是与肿瘤生长明显相关的膜分子。为探讨CKLFSF8转染后细胞的增殖被抑制的可能机制，我们研究了转染后细胞表面EGFR的表达，结果显示CKLFSF8质粒转染HL60细胞后EGFR表达明显降低，与对照组相比，有显着差异。

实验结果表明，趋化因子CKLFSF8基因可在HL60细胞株中表达，转染该基因后白血病细胞过表达这种趋化因子，且该基因对HL60细胞表面EGFR的表达有明显抑制作用，这提示CKLFSF8可能通过抑制HL60细胞EGFR的表达而达到抑制HL60细胞生长的作用。

目前对于这种新型趋化因子的结构已经有了比较深入的了解，但是对于它的功能研究很少，后续还需作许多体内外相关实验，比如趋化实验、动物实验等，以便对这种新型趋化因子有更全面深入的了解，为这种新型趋化因子的应用打下坚实的理论基础。从对这种新型趋化因子的现有研究结果来看，有望对白血病的治疗提供新的思路。

【参考文献】

1MurookaTT,WardSE,FishEN.Chemokinesandcancer.CancerTreatRes,2005;126:15-44

2LouY,XiaD,HanW,etal.Molecularcloningandcharacterizationofratchemokinelikefactor1and2.Gene,2003;307:125-132

3MantovaniA.Thechemokinesystem:redundancyforrobustoutputs.ImmunolToday,1999;20:254-257

4徐明旭,程宁,杨松桦等.CKLFSF1基因与CKLFSF2基因间存在的顺式作用元件.中国生物化学与分子生物学报，2003;19:349-353

5HanW,LouY,TangJ,etal.Molecularcloningandcharacterizationofchemokin