HIV病毒载量测定及质量保证指南

HIV-1病毒载量测定及质量保证指南HIV-1病毒载量测定及质量保证指南1HIV-1病毒载量测定及质量保证指南〔2023版〕GuidelineforHIV-1ViralLoadTestingandQualityAssurance中国疾病预防把握中心20231月前言HIV-11997HIV-1病毒载量检测技术以来，截至2023年底全国已经配备115台HIV-1病毒载量检测仪，掩盖疾控、医院、检疫、军队等系统，艾滋病流行重点地区及少数县级试验室均已配备HIV-1病13HIV-1病毒载量检2023HIV-1病毒载量测定及质量保证指南》〔试行，〕HIV-1病毒载量力气验证工作的试验室从2023年的29家增加到2023年的107家，占已开展工作试验室的百分之九〔1〕〔2〕HIV-1病毒载量检测方法”；〔3〕HIV-1〔PT〕”；〔4〕补充常见问题分析和处理等内容。修订后的《指南》共分八章，包括：总则，人员要求，试验室环境与设〔PT〕，试验室生物安全，以及四个附表。〔2023〕版。本指南由中国疾病预防把握中心性病HIV-1病毒载量检测试验室网络内公布实施。2023年公布的《指南》〔试行〕的根底上修订，在此对编写建议的HIV-1写主持人：蒋岩HIV-1止2023年公布的《HIV-1病毒载量测定及质量保证指南》〔试行〕。HIV-1 病毒载量测定及质量保证指南名目〔PT〕1常见问题分析和处理2HIV-1病毒载量检测样品送检及接收单3HIV-1病毒载量检测力气验证样品接收专用单4HIV-1病毒载量检测报告单参考文献缩略语意义HIV-1HIV-1病毒载量检测主要用于抗病毒治疗HIV感染的关心诊断，包括窗口期、病程晚期、婴儿感染、疑难样本等的诊断HIV-1目的HIV-1病毒载量检测工作，标准试验室质量把握与治理。适用范围HIV-1病毒载量检测工作的全部试验室。HIV-1病毒载量检测人员分为检验人、复核人、签发人。前方可开展相应工作。上岗培训内容至少应包括：HIV检测相关根底知HIV-1，生物安全。检验人进展HIV-1病毒载量检测的人员须具有艾滋病检测试验室的上岗资HIV-1HIV-1病毒载量检测质量的重要方面。试验室环境HIV-1病毒载量试验室应符合分子生物学试验室根本要求，包括试剂预备各区必需是相互独立的，有条件各区内可分别设置缓冲间，以保证不各区的仪器设备与各种物品必需为专用，避开穿插污染。试剂预备区和样品处理区内须保持低度正压〔或常压〕状态，使空气扩增产物分析区内须保持低度负压状态，使空气流向始终由室外向扩增产物分析区可以设在远离其他各区的地方。工作时必需遵循单一工作流向，即只能从试剂预备区开头，到样品处试验室设施HIV-1病毒载量检测方法除病毒载量检测仪外，还需要配备相应的HIV-1病毒载量检测试验室设备分布示意图供给HIV-1病毒载量检测试验室不同区内必备的关心设备及耗材。关心设备应样品处理区：生物安全柜：二级离心机〔32023g1.5mL离心管〕2-8-20-70℃以下0.5℃1套〔20μL200μL、1000μL〕带滤芯的一次性吸头〔无DNA和RNA酶〕，1.5mL离心管〔无DNA和RNA酶〕及相应试管架计时器旋涡振荡器：震惊频率可调一次性工作服、帽、口罩、无粉手套和鞋套HIV-1病毒载量检测试验室设备分布示意图病毒载量仪病毒载量仪加样器荡器

超净工作台荡器冰箱2-8℃ 冰箱-70℃ 箱-20℃

冰箱2-8℃扩增产物分析区 区

试剂预备区试剂预备区：超净工作台〔或密闭工作台〕1套〔20μL、200μL、1000μL〕〔18000g，适合1.5mL离心管〕2-8-20℃计时器旋涡振荡器，震惊频率可调带滤芯的一次性吸头〔无DNA、RNA酶〕1.5mL离心管〔无DNA和RNA酶〕及相应试管架一次性工作服、帽、口罩、无粉手套、鞋套扩增产物分析区：HIV-1病毒载量检测仪1套〔20μL、200μL、1000μL〕2-8-20帽、口罩、无粉手套和鞋套带滤芯的一次性吸头〔无DNA、RNA酶〕HIV-1病毒载量测定及质量保证指南HIV-1病毒载量测定及质量保证指南10HIV-1病毒载量检HIV-1样品的采集采样器材：一次性抗凝真空采血管、持针器、蝶形针等。EDTA〔乙二胺四乙酸〕ACD〔枸橼酸钠〕，须样品标识：在采血管上贴唯一性样品编号。8-10ml,采集的样品量应与定量采血管10次，使血液HIV-1病毒载量检测样品送检及接收单〔2〕的备样品的处理6小时内离心样品，室温下使用离心力为800-1200g〔1500-3000rpm〕10分装到无菌的聚丙签。血浆样品不能灭活。做好样品处理记录，包括冰箱温度变化、样品存取。样品的保存44℃临时保存，3-203-70℃以下。不能使用自动除霜冰箱。3次。监控并记录保存温度以及样品状态的变化防止样品变质、泄漏及污染。〔毒〕种或样本运输治理规定》的要求运输，并严格把握运输的冷冻状态，避开样品溶化。样品的发送和接收HIV-1病毒载量检测样品送检及接〔2〕。HIV-1〔附表2〕作HIV-14℃保存并尽快检测，记录冻融一次。HIV-1HIV(NASBA)技术，代表产品为实时荧光技术NucliSensEasyQ仪；分枝DNA信号放大系统(bDNA)技术，代表产品为bDNA440；实时荧光定量PCR扩增技术(real-timePCRCobasAmplicorTaqmanM2023检测5．1(NASBA)技术最早产品为NucliSensECL定量RNA测定方法，已经被NucliSensEasyQ一代实时分子信标定量扩增所取代。所承受的 NASBA技术是一种等温扩增系统，其扩增根底在于系统内的混合酶系统，此系统内含有逆转录酶AMV-RT和T7-DNA多聚酶在体外模拟逆转录病毒体内复制过程。NuclisensEasyQ结合NASBA技术、BOOM核酸提纯技术与分子信标探针技术(MolecularBeacon)检测血浆中的HIVRNA水平。这种结合方法使real-timeamplificationassay)，提高对诊断质量的NucliSensEasyQHIV-1的检测是利用靶特异的分子信标进展，分子信标的DNA寡核苷酸片段包含一段可特异结合靶RNA的序列。当RNA互补链不存在时，分NucliSensEasyQHIV-1HIV-1RNA的扩增子，另一个针对内标物RNA(calibrator)6-FAM，内标物使用6-ROX)，从而实现靶序列和内标物RNA两个扩增过程的各自跟踪。荧光信号的动力学分析可以显示野毒株和内标物RNA的转录速率，因此可以计算出原样本HIV-1RNA含量。DNA(bDNA)技术分枝DNA测定技术基于其独特的信号放大系统，即分枝DNA信号放大系统，为一个人工合成的分枝DNA，分枝DNA的分枝可结合多个酶标记物，bDNA检测通常包括以下步骤：〔1〕将患者血清或血浆连同含有特异的〔2〕孵育，释放病毒核酸，降解RNA酶或使DNA变性,然后靶探针结合到靶RNA或DNA并固定在固相板上；〔3〕〔4〕〔bDNA〕到各孔内；〔5〕孵育，使bDNA杂交到靶探针的相应部位；〔6〕冷却洗板；〔7〕加标记探针到各孔内；〔8〕孵育，使酶标记的探针杂交到bDNA上；〔9〕冷却洗板；〔10〕〔11〕〔RLUs〕表示。产生的光强直接与各样品中病毒RNA或DNA的拷贝数成正比。各样品中病毒核酸的含量由与样品一同处理的标准所制作的标准曲线计算获得。bDNA440病毒载量检测仪较bDNA340在孵育、冲洗和加样步骤由手动操实时〔real-time〕荧光定量PCR扩增实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反响体系中参与荧光基团，利用荧光信号积存实时监测整个PCR进程，最终通过标准曲线对未知模板进展定量Ct品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值〕Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量PCR扩增的试验检测过程可分为：〔1〕样品制备,抽提和浓缩目标RNA分子，并除去可能存在的抑制因子。〔2〕Real-timePCR，检测PCR的产物使用荧光标记的寡核苷酸探针。检测的原理基于荧光信号增长曲线与循环数相关。〔3〕RT-PCR反响，病毒RNA利用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，然后通过DNA聚合酶对特定片段进展扩增。〔4〕就能对样品病毒载量进展定量检测。目前此原理已为多种HIV-1病毒载量检测的的主要方法，包括CobasAmplicorTaqman检测系统、M2023检测仪和国内产品凯杰、达安以及正研制的定量检测试剂均属于该技术。CobasAmplicorTaqman检测系统是全自动化的实时荧光定量PCR病毒载量平台,具有样品进--结果出(sample-in,result-out) 的特点。此方法的检测过程为：装待测样品、放试剂和耗材、核酸提取、PCR反应体系制备、实时荧光定量PCR。Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光放射基团吸取；PCR扩增时，Taq5”－3”外切酶活性将探针酶切降解，使荧光放射增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而实现定量。M2023利用RT-PCR法，在开头制备样本时，对每个样本参与与HIV-1目标序列无关的RNA序列。这种不相关的RNA序列通过RT-PCR被同时扩增ICm2023rt仪器上，每个扩增循环中存在的HIV-1m2023rt系统HIV-1RNA浓度对数成比例。可以使用多款实时荧光定量PCR检测仪。不同方法检测结果间相互关系(CP)/ml(IU)/ml，且同一：〔1〕人员；〔2〕试验室分区和环境；〔3〕〔4〕检测过程〔试剂、操作过程、质控品使用〕〔5〕数据报告。人员HIV-1病毒载量检测人员分为检验人、复核人、签发人。复核人、签发人应具备对检测过程进展分析、解决问题的力气。试验室分区和环境6.2.1试验室分区的功能HIV-1试剂预备区：扩增试剂的配制、分装和保存；样品处理区：样品登记、分装，核酸提取、保存和加样；扩增产物分析区：产物扩增的测定、结果分析、登记及报告。三章。试验室环境的要求试验室有足够的空间；采光好，应避开阳光直射设备；18~25℃；30~70%；HIV-1病毒载量检测仪应配备稳压电源；室内保持干净干净，无灰尘；75%0.1%次氯酸钠准时处理操作台面。仪器设备质控加样器、温湿度计须经计量部门校准，每年一次，每半年期间核查HIV-1病毒载量检测仪及其配套仪器可以托付公司校准，每年一次。离心机可以托付计量部门或公司校准，每年一次。冰箱、水浴箱用校准合格的温度计测量温度，每次做好记录。检测过程质控试剂质控使用经国家食品药品监视治理局注册的试剂。全部试剂盒须严格按要求条件保存。试验用水：要求使用无DNA和RNA酶的去离子水。操作过程质控〔SOP〕，并质控品的使用质控要求。同时使用外部质控品〔HIV病毒载量值为5000-15000拷贝/毫升质控品〕，外部质控品的制备、定值及使用制备对用于制备质控品的大样本血浆样品，要求用EDTA抗凝剂抗凝，颖0.2微米的滤膜过滤除菌，-70℃以下非自动除霜冰箱内，避开反复冻融。按实际使用量的〔推举每次配置量可使用两年〕定值5管，严格依据试验室的各自方法HIV-1IU值换Log10值，计算其算术平均值〔M〕和标准偏差〔S〕。质控图的绘制和使用2S3S线图，作质控图Log10值2.0s内方为有效。使用批次的外部比照质控品时，必需重绘制质控图。质控品不宜使用稀释方法制备。数据分析、结果报告在试剂盒及外部质控品结果满足要求的前提下，对样品进展分析。外部质控品不合格，样品需要重检测。结果超过检测上限的样品应稀释以后重检测。复核人对检测结果进展认真复核并对结果提出结论、签字。签发人对结果的结论进展审核、分析、总结、签字。//毫升为单位报告样HIV-1病毒载量值。第七章试验室检测力气验证〔PT 〕HIV-1HIV-1/丙肝参比试验室或有资质的国内HIV-1病毒载量检测力气验证来实施外部质量把握。PT组织艾滋病/HIV-1病毒载量检测力气验证〔PT〕的组织HIV-1病毒载量检测力气验证的打算并组织实施。HIV-1PT工程，在规定时间内使用有效试剂与试验样品一起检测，填写HIV-1病毒载量检测报告单〔4〕，/丙肝参比试验室。PT活动。PT实施PT5份。包括阴性、不同拷贝数的阳性样品。PT2次。PT样品的接收与保存：要求参与PT的试验室收到考核样品后，HIV-1病毒载量检测力气验证样品接收专用单〔附表3〕，3天内传回艾滋病/丙肝参比试验室。如觉察考核样品缺失/丙肝参比试验室负责补寄-70度以下保存。PT样品的检测：要求将考核样品同试验室常规样品一起检测，由PT结果的报告和处理：参与PT的试验室必需在规定的时间内，HIV-1病毒载量试验结果报告单和/丙肝参比试验室，艾滋病/丙肝参章的书面申请。评分原则将参与试验室反响结果换算成对数值〔Lg〕，再按同一种方法与同一个〔M〕和标准偏差〔S〕。〔款〕，判定标准为：②良好：有一个考核品满足中的条款；③合格：两个考核品满足中的条款④不合格：至少有三个中的条款。M+2.0S～M+3.0SM-2.0S～M-3.0S内；考核结果报告没准时上报；没按要求上报原始记录。>M+3.0S<M-3.0S；假阳性；假阴/丙肝参比试验室依据各试验室的两次考核在收到结果后10天内向艾滋病/丙肝参比试验室提出异议，后者在核实状况/丙肝参比试验室组成技相关依据〔毒〕种或样品运输治理规安全细则进入试验室应穿工作服、戴口罩、戴一次性乳胶手套。严禁在试验室内进食、饮水和吸烟以及使用扮装品。全部样品包括试剂盒中的人源性成份〔如阴、阳性比照〕都应在生物安全柜内进展处理。0.1%次氯酸钠溶液或其它消避开试剂盒中各种有毒有害化学成分〔如叠氮钠、二甲基亚砜、异硫氰酸胍〕对人体或环境可能造成的危害。生物安全培训HIV-1病毒载量检测的人员都应经过严格的安全培训，要把握生物安全保障的原则、措施。每个人的安全教育均应记录在试验室和人事档案中。HIV/AIDS检测生物安全培HIV-1病毒载量检测培训。检测相关人员应主动承受试验室生物安全员以及安全负责人的监督。全部试验室意外大事均应进展记录和报告。全部人员要保护自身和环境的安全。参照试验室安全指南和标准操作程序的有关规定执行具体操作。职业暴露处理试验室应建立完善的艾滋病职业暴露后的预防机制。发生职业暴露后，首先进展应急处理，然后依据暴露级别和暴露源头严峻程度，评估风险级别，并打算是否进展预防性用药和用药程序，如需要时，尽早开头服用抗病毒药物。按规定进展职业暴露登记、检测和报告，留意做好保密工作。附表1 常见问题分析一〕EasyQ问题〔消灭错误代码〕 处理方法1：未检测到信标

〔如样本〕2：内标数据与野生型数据由公司工程师解决软件收集数据出不符3：曲线中断

使用稳压电压a、标本中有严峻的溶血、脂血和纤浑2023g，5-6分钟。b、充分裂解样品。cd、加硅胶后，e、清洗过程中要洗1g、洗脱后马上将核酸和硅胶分别。〔核酸又被硅胶吸附〕h、转移核酸时避开吸入硅胶。错误代码4：无扩增 i、充分溶解引物，马上振荡溶解。j、充分溶解酶。放置时间要大于15分钟。复溶时需在室温下进展。k、用准确的微量加样器参与足量引物。l、排解排管底部的气泡，排管放到孵育器上时需压紧。m、充分振荡排管，完全混匀反响体系液体。n、密封保存排管、离心管等耗材。op、41错误代码5：弱扩增反响排管。错误代码6：计算错误检查电脑软件错误代码7：特别扩增正确参与核酸，保持电压稳定，严格把握引入抑制物。错误代码8：延迟时间过短参与酶后准时进展扩增，操作娴熟。错误代码9：弱扩增4。应留意操作细节避开错误发生。10：未检测到内标

本11：信息不全12：延迟时间过长二〕bDNA问题 处理方法

再进展检测。操作时留意事项参考4和9中细节避免错误发生。导出结果，曲线截图，公司工程师解决。注射器含有气泡

加适量的溶液在空瓶里；管路都在各自的瓶内液面下。底部的加热托检查管路连接。盘上有液体管路有堵塞或细菌滋生 瓶；每周清洗洗液瓶,水瓶和废液瓶，管路系不能从孔内吸检查废液管连接头取足够的液体RLU值低

确定按产品要求储存、配制试剂；环境温度在18-30确定全使用干净的一次性无菌试验材料；使用防气RLU值高 70%乙醇定期擦洗微量加样器；盛洗液的进展保养；分析仓门关闭严实；检查背景RLU确定微量加样器经校准；使用防气溶胶的枪头；枪头严密套在加样器上；加试剂时枪头位置在孔的中部；样品凝块或残渣没有被吸取；样品加的位置与样品ID和DMS规定的位置全都；样品按产品说(CV)高

处理和储存；只使用干净的一次性无菌以防有沉淀；RLU背景。标准曲线平坦或不正加标准时板的缺口在左边常强或弱比照定量高

未触及邻孔；使用无菌枪配制。确定试剂盒在运输和到货后储存在正确的温度；使强或弱比照定量低 用无菌枪头；没有吸取气泡；封闭垫组装无误；加防止溅洒；标准打液不均匀排液剩余WA打液不均匀排液剩余WA于0.05IRL试验过程中一孔或者配制；,标准5秒。检查抽洗轴头是否堵塞，假设有堵塞，卸下后用注射器疏通。检查用于进展背景检查的白色间隔反响孔是否被污，检查光路读数头是否有破损漏光现象几个孔消灭WA2435或染，管路是否有堵塞或者漏气现象，反复清洗管者WA2437报警，但仪路。检查抽洗轴头是否堵塞。器没有停机，消灭报警的孔没有试验结果。仪器底部洗站四周出检查蠕动泵管是否有裂开或者安装错误，检查洗站现水迹或者有明显漏和排液管连接是否有裂缝。水试验过程中消灭CL开检查板架四角磁铁是否有脱落现象，用AB胶粘头的错误代码好。试验完成后翻开舱门，查看房间湿度是否低于60%，开除湿机除湿。打觉察试剂仓中部有明显积水开仪器舱门，在仪器舱内部放少量固体枯燥剂问题 处理方法设备消灭未预料的资源错误 重启动设备和AMPLILINK软件AMPLILINK软件消灭数据库错误 热循环区域消灭：TC温度同步化；TC盖同步化cmd样本量不准确

重启动设备为扫描机硬件错误，重启动设ID0.970ml1.030ml均不行检测附表2HIV-1病毒载量检测样品送检/接收单送检单位送检单位送样人期采样时间凝剂运输保温方式姓名性别年龄现住址户籍所在地是治疗号：是否治疗否样品编号样品性质样品量〔ml〕备注接收单位接收人接收日期附表3HIV-1 病毒载量检测力气验证样品接收专用单试验室名称接收日期试验室名称接收日期编号收到考核品量体积〔ul〕外包装是否完整是否考核品状态冰块是否溶化是否样品是否溶化是否打算检测日期检测方法4℃-20-80接收人试验室负责人附表4HIV-1 病毒载量检测报告单送检单位姓名 性别 年龄国籍或民族 职业现住址送检日期 送检样品编号 HIV-1病毒载量(copies/ml,IU/ml)检验人复核人检测单位或试验室〔公章〕

签发人 备注1、检测方法：

年月日2、检测限：参考文献2023。《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测质量把握指南》，2023。1998。Virologymannul,1997.“:///daids/vir_manual/full_vir_manual.pdf“:///daids/vir_manual/full_vir_manual.pdf .GuidelinesfortheUseofAntiretroviralHIV-InfectedAdultsandAdolescents，MMWRRecommendationsan