版药典微生物限度检查法操作要点

０5林丽英05前版本的药典没有要求对检验方法进展必要的验证，所以大家都觉得不好理解、不0验证时的操作要点与大家作个探讨。一、验证的目的由于制剂在投料和加工过程中，或有抑菌成份存在，或由于各种成份相互作用的结果,将可能对某些类型的微生物的检出产生影响。对所建立的微生物限度检查法进展验证的目的,就是要对每个样品使用适宜的检验方法，顺当的检出样品中污染的各种类型的菌。细菌计数验证所用的菌株:大肠埃希菌［ＣMCC(B〕4４102]：代表革兰阴性菌；[CMＣC〔Ｂ)2600３]：代表革兰阳性球菌;枯草芽孢杆菌[CＭＣC〔B〕63501]:代表革兰阳性杆菌;霉菌计数验证所用的菌株：[CMCC(F〕９800１]：代表酵母菌;黑曲霉［CＭCＣ(F)980０3:代表霉菌；由于每个菌株代表不同类型的菌，所以只有这五个菌株的回收率均到达要求,才说明样品中污染的各种类型的菌都可能检出来，否则，所得的结果是不能真实地反映样品的污染状况的。菌液的制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的颖培育物至养分18～２4,24~48.含菌数为５0～ｌ００cfu的菌悬液。接种黑曲霉的天，参加３～5ｍl0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后，吸出胞子悬液〔用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤)至无菌试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数50~l00cfu的孢子悬液。二、方法的验证全部验证方法的操作均应在阳性接种间。〔一)、细菌、霉菌和酵母菌计数法的验证验证方法3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌株每次试验的回收率。常规法50～１001个平皿中，马上倾,2个平皿,培育,计算各菌株的回收率。,需要多少个平皿呢？试验组：5×2=1０个,2ml共需１０个；菌液组:5×2=１0个,即每个菌株的加菌量，每株2个皿。 本底菌组：2个细菌计数,2个霉菌和酵母菌计数。146,6,4,2倾注玫瑰红钠琼脂培育基(虎红琼脂培育基)。回收率=[〔试验组菌数－本底菌组菌数)／菌液组菌数]细菌计数用该验证的方法检验。当白色念珠菌和黑曲霉27０%以上时,霉菌计数用该验证的方法检验。培育基稀释法2mllm1ｍl供试液的平均菌落数，按平皿法计数规章报告菌数;掌握菌检查时，可加大增菌培育基的用量。具体操作:(1mｌ5个皿为例〕1:１01mｌ50．2mｌ，每株试验菌平行制备2ml的平皿数,,计算各菌株的回收率。,需要多少个平皿呢？试验组：5×10=50２ｍｌ50个；菌液组:5×2=10个,即每个菌株的加菌量,每株２个皿。 本底菌组:10个细菌计数，1０个霉菌和酵母菌计数。离心沉淀集菌法取肯定量的供试液，3０00转/20分钟〔供试液如有沉淀,5０0转/〕，弃去上清液,2mｌ，加稀释液补至原量。然后用此稀释液进展检验。薄膜过滤法1glml供试品的供试液,1ｇlml所含的菌数较多时,可取适宜稀释级的供试液ｌｍl,过滤。无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜。冲洗后取出滤7个膜。(52个本底菌〕〔二〕掌握菌检查方法的验证菌株，验证大肠菌群检查法时，应承受大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和掌握菌检查法的规定及以下要求进展。菌种对试验菌种的要求同细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。大肠埃希菌(Escｈｅriｃhiａcoli)[CMCＣ〔B〕44102]金黄色葡萄球菌(Stａｐhylｏcｏccuｓaurｅuｓ〕(ＣＭCC(Ｂ)2600３)乙型付伤寒沙门菌(SaｌmonelｌaｐaratyphiＢ〕(ＣＭCC〔B〕５0094〕铜绿假单胞菌(Psｅudomｏnａs ａerugmosa)〔CMCC(B)10104)生孢梭菌(Closｔｒidiuｍsporoｇenｅs)(ＣMCC(B)6494１)菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的颖培育物至养分肉汤培育基或养分琼脂培育基中，生孢梭菌的颖培育0．9%无菌氯化钠溶液制成每验证方法,取规定量供试液,过滤,应加在最终一次冲洗液中,过滤后，注入增菌培育基或取出滤膜接入增菌培育基中。〔2〕阴性菌比照组设立阴性菌比照组是为了验证该掌握菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性比照菌承受金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时的阴性比照菌承受大肠埃希菌。阴性比照菌不得检出。结果推断,按此供试液制备法和掌握菌检查法进展供试品的该掌握菌检查;假设试验组未检出试验菌，应承受培育基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消退供试品的抑菌活性,并重进展方法验证。三、检验方法(一〕计数法的检验计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时,按已验证的计数方法进展供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。平皿法查。承受平皿法进展菌数测定时,应取适宜的连续2～3个稀释级的供试液。〔培育基稀释法,1ml供试液均匀个或以上的平皿中),1５～20mｌ45℃的溶化的养分琼脂培育基或玫瑰红钠琼脂培育基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培育基,混匀,凝固,倒置培育2个平板。阴性比照试验取试验用的稀释液lmｌ，置无菌平皿中,注入培育基,凝固，倒2个平板，均不得有菌生长。培育和计数除另有规定外，细菌培育48小时，逐日点计菌落数,48小时的菌落数报告;霉菌、酵母菌培育72小时,逐日点计菌落数，一般以72小时的菌5~7天进展菌落汁数并报告。菌落集中生告规章报告菌数。假设同稀释级两个平板的菌落平均数不小于１５，则两个平板的菌1倍或以上。;玫瑰红钠琼脂培育基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培育基用于酵母菌计数。在特别状况下,假设养分琼脂培育基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培育基上长有细菌，则应分别点汁霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将养分琼脂培育基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培育基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培育基中的霉菌和酵母菌数或养分琼脂培育基中的细菌数进展比较，以菌落数高的培育基中的菌数为计数结果。胨葡萄糖琼脂培育基测定酵母菌数，合并计数。30~300,作为菌数报告〔取两位有效数字)的依据。(１)1个稀释级的菌落数符合上述规定,以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。(比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值)而定。假设比2但不超过５时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数;5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等特别状况时，应查明缘由再行检查，必要时,应进展方法的重验证。３30,数的值报告菌数。(４)如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生1时，以<１乘以最低稀释倍数的值报告菌数。薄膜过滤法承受薄膜过滤法,滤膜孔径应不大于０.４５μｍ,直径约为５0mm。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应承受适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分枯燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应留意保持供试品溶液及冲洗液掩盖整个滤膜外表,100ml。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避开滤膜上的微生物受损伤。1g或ｌmｌ供试品的供试液，加至适量的稀释剂中,混匀,1ｇlｍｌ所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液ｌmｌ,过滤。用pＨ7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证玫瑰红钠琼脂培育基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培育基平板上培育。每种培育基至少制备一张滤膜。阴性比照试验 作,作为阴性比照。阴性比照不得有菌生长。培育和计数培育条件和计数方法同平皿法,每片滤膜上的菌落数应不超过100个。菌数报告规章以相当于1g或ｌmｌ落生长,以<1报告菌数(每张滤膜过滤1g或1ｍl供试品),或<１乘以最低稀释倍数的值报告(二)掌握菌检查法,增菌培育基的实际用量同掌握菌检查方法的验证。阳性比照试验供试品进展掌握菌检查时,应做阳性比照试验。阳性比照试验的菌。阴性比照试验取稀释液10m1照相应掌握菌检查法检查，作为阴性比照。阴性比照应无菌生长。根本程序:供试液制备 增菌培育 选择性培育基培育 似菌落 生化试验 报告结果１．大肠菌群的检查ｍ、1：１0０0lml(0．０01g0．001m１1lml1８～２４小时。,判该管未检出大肠菌群;假设产酸产气，应将发酵管中的培育物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培育基或麦康凯琼脂培育基的平板上,18~24小时。假设平板上无菌落生长,2所列的菌落形态特征不符或为非革兰2所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌,应进展确证试验。表２大肠菌群菌落形态特征培育基培育基曙红亚甲蓝菌落形态琼脂滑，潮湿麦康凯琼脂鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起,边缘整齐，外表光滑,潮湿确证试验从上述分别平板上选择4~5个疑似菌落,分别接种于乳糖发酵管中,培育菌群。31glmｌ供试品中的大肠菌群数。各供试品量的检出结果可能的大肠菌群数各供试品量的检出结果可能的大肠菌群数N/gｍl)0.1g0.1０．01g0．001gｍl0.0１mｌ0.0０1mｌ+++>103++-１０2<N<１03+--1０<N<１０2－--<1０注:+代表检出大肠菌群；一代表未检出大肠菌群。2.梭菌检查8010分钟后100ml的颖庖肉培育基中。7２～9６小时。如试验管不消灭浑浊、产气、消化碎0.2m1,涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培育基平板上,在厌氧条件下培育４8~７２小时。假设平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；假设平板上有菌落生长，应选择２～３个菌落分别进展革兰染色和过氧化氢酶试验。,3%过氧化氢试液,