微生物种群的鉴定方法选择

谱图、荧光原位杂交DNA标记、单链考。PCR-DGGE(Polymerase Chain Reac-tion and Denaturing Gradient Electro-phoresis)DGGE原理FischerLerman1979年最先提出的，1993Muzyers等首次将DGGEDNADNADNADNA分子在含梯度变性剂(尿素、甲酰胺)DNADNA序列迁移到变性凝胶确实定位置，并到达其解链温度时,即开头局部解链，解链程度越大，迁移阻力大，DNADNA片段则停留于1DNA片段。PCR-DGGE在人工湿地争论中的应用微生物数量、丰度及多样性Dong等用PCR-DGGE技术鉴别分析用来处理猪圈废水的湿地基质中微生物水中微生物的多样性及丰度显著降低，其优势种为Pseudomonassp.(假单胞菌),Arthrobac-tersp.节细菌属),Bacillussp.杆状菌)。通过系统发育分析说明一局部16SrRNA的基因序列与不行培植的反硝化细菌具有极大的相关性，而这些反硝YinDGGE技术分析处PCR对携带单加氧酶的基因序列进展扩增，得Guo等利用PCR-DGGE技术分析人工湿地处理二级废水后混合水中的微生物群落的构造，GorraPCR-DGGE技术鉴别处理污水的湿地基有很大的区分，其中沸石最有利于氨氧化细菌的活动。特定微生物功能群PCR15个位点鸟分支杆菌)有良好的去除作用，因而对鸟类肺结核具有有效的把握作用。Park(2023)通工湿地中脱氮菌和除硫菌的活动状况。Ruiz-RuedaPCR-DGGE技术鉴别了湿地中阔叶香蒲和芦苇根际的硝化反硝化菌的活动及其群落构造，并推断它与湿地中的植物种类的相关性。Huang等应用PCR-DGGE技术调查处理富养分赏识水的复合垂直流人工湿地中氨氧化细菌的16SrDNA基因探针和功能PCRDGGE及核苷酸序列分析，以检测用来处理高氮浓度的垃圾掩埋浸析液的人工湿地中硝化和反硝化作用及其相应的菌群。LH-PCR(LengthHeterogeneityPCR)LH-PCR1998LH-PCR中，荧光Nancy等(2023)LH-PCR技术评估土壤微生物群的组成，并觉察LH-PCRAhnLH-PCR在不同湿地植物和磷负荷下采集人工并应用主坐标分析及相像性分析得出高磷负荷会使基质微生物群落构造发生显著转变且能降低其多样性，克隆排序说明不同的磷含量产生不同的微生物群落。T-RFLP(Terminal-RestrictionFrag-mentLengthPolymorphism)T-RFLP〔末端限制性酶切片段长度多态性〕PCRRFLP技PCR16SrRNA基的条带都代表一个“核型”或一个分类单元。相对于其它分子生物学分析技术如RFLP、DGGE等，它具有区分率高、易于实现自动化等特点。Nicorarat等利用T-RFLP技术对处理酸化煤矿水的人工湿地系统中微生物的多样性进展分析将RFLP的结果与从前的有机体培育PCR-DGGE和FISH争论结合起来说明白相对低的微生物多样性及嗜温硫杆菌在好氧湿地基质中具有优势。Ishida等通过T-RFLP方法测定不同的水力负荷及水位波动对湿地底泥中微养分物的去除状况确定湿地的性能Searcy等利用PCR扩增每个生物菌膜样本上真核细菌的 16SrDNA及亚硝酸复原酶基因，用T-RFLP技术分析扩增产物推断整个菌群及反硝化细菌群落的多样性。Sleytr等利用T-RFLP技术分析比较芦苇湿地和芒竹湿地植物根区的微生物群落构造觉察不同的湿地在相像的条件下运行具有相像的菌群构造。PCR-SSCP〔SingleStrandConforma-tionalPolymorphism〕PCR-SSCP根本原理单链构象多态性技术(简写为SSCP)是随着人类基因组的争论而进展起来用PCR方法相结合，PCR扩增产物经变性后，将DNA置于非变性的聚丙烯酰胺凝胶上进展电泳，空间DNA会因其迁移率不同而得到分别，最终依据电泳条带所显示的亮度、丰度、条带位置和清楚度等根本信息进展SSCP图谱分析，确定不同菌PCR-SSCP技术被认为是环境微生物分子生态学争论中，继变性梯度凝胶电泳(DGGE)和末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)之后的又一技术。PCR-SSCP在人工湿地中的应用谢冰等(2023)PCR-SSCP技术对上海梦清园芦苇人工湿地的底泥微生物群落构造进展了争论，觉察湿地中微生物优势种主要是七种芽孢杆菌。XIEB等(2023)PCR-SSCP图谱分析上海梦清园芦苇人工湿地进出口微生物能群的分布与湿地中不同养分水平有关。Vacca等(2023)PCR-SSCP图谱分不同的微生物群落的存在与基质类型有关。ARDRA(AmplifiedRibosomalDNARestrictionAnalysis)限制性酶切片段分析法(ARDRA)PCRrDNA片段(如16SrDNA23SrDNA16S-23SrDNA片rDNA片段进展限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)。该方法的步骤是：rDNA片段扩增出来；3)选择多种有四对碱基识别位点的限制性内切酶，对扩增产物进展限制性酶切；4)用低熔点琼脂糖凝胶电泳分别酶50%96.3%的硝酸盐DNA的群落图谱以测定湿地基质中、植物根区及水中主要的微生物组成，并建立菌克隆文库，其中300多个克隆体用ARDRA分析并整合到运算分类单位中，得出湿地基质中、植物根区及水中35、31、3650%100%的要高。土壤微生物群落和数量鉴定的方法“分解者”反响，担负着地球C、N、P、S等物质循环的“调整器”土壤养分植物有效性的“转化器和污染环境的”净化器”等多方面生态功能［P］。土壤微生物是气候和〔基因〕多样性、生态特征多样性和功能多样性。目前，对污染土壤微环境的高度异质性，时间和空间上的小环境随时发生变化［R］。另外，栖息在括生物化学技术和分子生物学技术［S］，将它们的原理、优缺点、有用性及其进展动态作一阐述，以利于今后的争论。污染土壤微生物群落构造多样性的测定方法传统微生物平板培育方法传统的微生物平板培育法就是依据目标微生物选择相应的专性固体培育基［T］。平板计数法照旧是一个评价污染效应的有效方法。Busse等用平板计数法争论了草甘膦除草剂对造林土壤中微生物群落构造及高除草剂含量，降低了培育基中存活细菌的生长速率和代谢多样性。时满足全部微生物对温度、pH以及通气状况等条件的要求，从而用某一种特定中表现出一种”存活但不能培育”息，只能获得一小局部土壤微生物群落。迄今为止，只有不到1%的土壤微生物生物群落构造的真实信息。FLFA谱图分析法磷脂脂肪酸〔PhospholipidFattyAcid，FLFA〕是构成活体细胞膜的重要组途径形成不同的FLFA，局部FLFA总是消灭在同一类群的微生物中，而在其它类群的微生物中很少消灭，细胞死亡后数分钟到数小时内细胞膜水解和释放磷脂，FLFA被降解，可以代表微生物群落中”存活”的那局部群体。不同菌群的微生物生物量群落组成各不一样，每种样品具有独特的FLFA谱图〔包括FLFA总量、组成〕，FLFA谱FLFA分析法是用氯仿-甲醇-柠檬酸缓冲液〔1:2:0.8〕提取土样的脂类，用柱层析法分别得到磷酸酯脂肪酸，然后经甲酯化后用气相色谱分析各种脂肪酸〔C5-C20〕的含量。该方法在污染土壤的微生物群落组成和种群变化方面争论得到越来越广泛方法争论它们对林地土壤殖质土壤和农业耕地，然后检测其FLFA组成，对这两种土壤微生物群落的磷脂比生物量和活性的变化要小。用FLFA方法觉察Zn污染土壤中指示菌根真菌和放相对含量下降，微生物群落构造发生了变化。Suhadolc等用FLFA分用磷灰石处理降低重金属有效性和补充重金属来提高其有效性两种方式均转变了土壤微生物群落构造。：〔1〕温度波层相，进而影响细胞膜的渗透性。FLFA成分发生适应性变化以转变膜的流淌性变化是生物体内消退这些影响的机制之一。〔2〕饥饿，养分状况的变化也有可标记性水平上区分微生物。基于PCR的分子生物学技术扩增核糖体DNA限制性分析法〔AEDRA〕DNA限制性分析法是一种DNA:PCR扩增16srRNA基因，所得片段用限制性内切酶消化，并用琼脂糖凝胶电泳分别。此方法物群落构造及其多样性的争论。Smit等用扩增的核糖体DNA:限制性分析法争论只代表了总的细菌种群的一小局部；同时说明扩增的核糖体DNA:限制性分析法Zn对自养型细菌的影响，结果显示随着Zn浓度的增加，各土样中细菌的代谢多样性随之削减。Moffett等用扩增核糖体DNA限制性分析法比较了Zn污染土壤与非污染土Zn毒害胁迫明〔分类群中可得到几个片段，造成区分率较低。限制性片段长度多态性分析法〔RFLP〕PCR限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)，是将PCR引物中的一条加以荧光标记，反响后用适宜的限制生物种群的变化。Sandaa等用PCR-RFLP方法评价了重金属污染对土壤中可培育性，同时证明白可培育细菌种群只代表了土壤细菌群落的一局部。末端限制性片段长度多态性分析法〔T-RFLP〕末端限制性片段长度多态性分析法是对AEDRA技术的改进土壤细菌的16S核糖体DNA和真菌核糖体DNA的ITS区域都是争论土壤微生物多样性格外重要的目标区域T-RFLP就是依据样品中的这些目标区域DNA序列的不同或变化，进展PCR扩增后得到目标DNA片段酶切后将会产生不同长度的限制性片段依据这些特异片段的数量可以推断区系的多样性还可依据序列鉴定到种通过比较不同样品间的异同，该方法能为评估土壤微生物多样性供给更敏感的数量化根底。 Turpeinen等用T-RFLP方法争论了As、Cr、Cu污染土壤的微生物群落构造，结果提示了微生物能对土壤重金属污染产生响应作用并通过转变微生物群落构造和产生耐性的方式来维持其代谢活性。结果的关键因素；〔3〕随着片段长度的增加，测序仪检测区分率降低等。2.3.4核糖体基因间隔区分析法〔RISA〕核糖体基因间隔区分析方法是利用细菌群落概览图谱间的相像度对生态系统的空间异质程度进展定量分析。RISA以RISA概览图谱Ranjard等用PCR-RISA分析法争论了Hg对细菌群落构造的影响，觉察在Hg污染胁迫下，优势细菌种群的组成发生了变化，耐Hg细菌变多，细菌群落多样性削减。该方法的一些缺乏之处也是不能无视的。如一般只能分别大小相差十几个BP的DNA片段，对于差异小到几个甚至一个bp的DNA片段则很难区分。因此该方法在精度上受到确定限制。2.3.2变性/温度梯度凝胶电泳技术〔DGGE或TEEG〕同样大小的DNA,序列由于含有的碱基不同，各片段的Tm也就不同，甚至一个碱基对的不同，都会引起Tm很大的差异。变性梯度凝胶电泳〔DGGE〕技术是通过不同序列的DNA片段PCR扩增DNA胶电泳〔TGGE〕技术的根本原理与DGGE技术相像，含有高浓度甲醛和尿素的PCRR产物及目的少，可以分析土壤样品中微生物的多样性。该技术最先由Muyzer等人引入争论土壤微生物基因多样性，现已被证明能。Kozdroj等用PCR-DGGE结合传统培育方法争论了根系分泌物对受不同程度Kehella等用PCR-DGGE方法争论了Cd污染对土壤微生物群落构造的影响，在高浓度Cd污染下，细菌群落也只发生了微小的变化，是由于有效Cd浓度过低，说明高浓度但低有效态Cd污染主要诱导微等用PCR-DGGE说明，PCR产物经DGGE检测后得到的电泳条带清楚且分别效果好，可以明显反构造多样性发生变化。Brim等用PCR-TGGE方法争论了Zn污染土壤的细菌群落，指出TGGE方法所显示的细菌群落多样性要高于用培育方法所获得的多样性。而且花费时间较多、费用昂贵，还有代表性不强等。3污染土壤微生物功能多样性的测定方法由于微生物群落在污染土壤的有机质分解、N、C物质循环以及生物修复等方功能多样性的争论主要承受基于碳素利用的BIOLOG微平板分析方法。BIOLOG微平板分析方法是由美国BIOLOG公司于1989应用于纯种微生物鉴定。1991年，Garland和Mills开头将这种方法应用于土壤微生物群落的争论，并认为BIOLOG碳素利用法是一种较为先进的争论不同环境下的土壤微生物群落构造95种碳源的利用力气及其代谢差BIOLOG微平板是一种多底物的酶〔仅有指示剂〕95个反响孔组成，每个反响孔装有光值来指示微生物对95能代谢力气差异状况。Engelrn等用BIOLOG争论了除草剂对能多样性的变化。Banerjee等用BIOLOG分析了浇灌污水污泥对土壤微生物群落的土壤微生物量和N的矿化速率并没有变化或增加。杨永华等利用BIOLOG方法用BIOLOG草剂在使用浓度较高时〔10mg/kg〕明显降低土壤微生物多样性，并且这种抑制BIOLOG方法争论了铅锌银尾矿区土壤微生物其土壤微生物群落构造发生了相应变化，尾矿区土壤微生物群落代谢剖面〔AWCD〕属污染引起了土壤微生物群落功能多样性的下降。BIOLOG方法不仅灵敏度高，区分力强，测定简便，而且无需分别培育纯种BIOLOG方法中所使用的微平板具有确定的选择性，比方BIOLOGGNBIOLOGGP微平板只适用于革兰物群落构造与功能及其相互关系，从而获得更全面的结果。结合方法生物化学技术和分子生物学技术都能很好地描述污染土壤微生物群落构造面的信息，必将成为今后争论的有力工具。MullerPCR-DGGE以及BIOLOG方法争论了Hg污染对土壤微生物群落，特别