分子生物学实验技术实验操作指南

2试验操作指南》名目植物基因序列分析 3引物设计的原则 4\l“_TOC_250008“试剂的配置和灭菌 5\l“_TOC_250007“植物基因组DNA的提取 6\l“_TOC_250006“DNA的定量 8\l“_TOC_250005“DNA的电泳 9\l“_TOC_250004“PCR产物的回收 12\l“_TOC_250003“PCR产物连接T载体和感受态细胞的转化 14\l“_TOC_250002“菌落〔液〕PCR 17\l“_TOC_250001“质粒DNA的提取 19\l“_TOC_250000“质粒DNA的酶切 211植物基因序列分析1植物基因序列分析3基因组DN〔genomicDNA,gDN：功能基因包括三个根本序列5上游区，转3’下游区。5’上游区和3’下游区：转录起始位点上游和转录终止位点下游的序列，主要起到基因表达调控作用。RNA最终被加工为成mRNA。信使RN〔messengerRNA,mRN由DNA遗传信息的能指导蛋白合成的一类单链核糖核酸。由编码区、上游的5’非编码区和下游3’非编码区组成，5’7-甲基鸟苷-三磷酸帽子构造，3’端有多腺苷酸尾巴。互补DN〔complementaryDNA,cDNA具有与某mRNADNA。蛋白质编码区〔sequencecodingforaminoacidsinprotein,CDS〕：与蛋白质序列一一对应的DNA序列，且该序列中间不含其它非该蛋白质对应的序列。只有外显子，不含内含子。’非翻译区5untranslatedregion,5’UTmRNA位于基因转录起始位点至编码区翻译起始密码子之间挨次。3’〔3-untranslatedregion,’UTmRNA段不被翻译的序列。2引物设计的原则2引物设计的原则420-25bp500bp16-18bp的引物；5kb，则需要用更长的引物。加有酶切位点的引物可适当延长。引物的特异性：最好在模板cDNA的保守区内设计，设计好后需要通过序列比对判别其特异性。引物GC含量：GC40%－60%45-55%为宜。引物Tm：TmDNADNATm7255-80Tm=2(A+T)+4(C+G)引物序列随机性：ATGC5个以上嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。引物自身：不能含有很长的结实的自身互补序列，尤其是引物3‘引物自身：不能含有很长的结实的自身互补序列，尤其是引物3‘端回折形成的发夹一3bp。引物之间：两个引物之间不应有很长的结实的互补或同源碱基，尤应避开3’引物之间：两个引物之间不应有很长的结实的互补或同源碱基，尤应避开3’端的互补重叠。重叠。3’3’末端和模板的碱基完全配对；防止发夹构造和二聚体形成。引物的5′端：引物的5′端可以修饰，加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列。53试剂的配置和灭菌一、试剂的配置：利用电子天平称取固体试剂或者量筒〔或移液器〕量取液体试剂溶于适量的溶剂。如需调整pH值，需要pH计的测定下用酸或碱滴定至目标pH。试剂配置的原则是先配置浓度高的各组分溶液，然后再将各组分溶液混合获得各种缓冲溶液和试剂的贮存液，灭菌后低温保存，需要时再稀释到工作液浓度使用。二、试剂和耗材的高压蒸汽灭菌：在高温高压条件下，利用湿热使细菌、真菌、芽孢、孢子等微生物的蛋白变性，进而死亡到达灭菌的效果。主要适用于耐高温、高压，不怕潮湿的试剂与耗材。预备：向高压蒸汽灭菌锅内加水至水位标记线，将预备灭菌的试剂及耗材用牛皮纸包好，装入锅内套层中〔物品放置不宜过多，锅内应留出确定空间；然后拧紧锅盖。加热：加热，当压力表上升到所需压力时〔一般为100KPa/12℃，灭菌15-30mi。完毕：待压力表降至“0”时，翻开锅盖，取出灭菌物品。留意事项：严格遵照操作规程，防止意外事故发生；易燃，易爆物品禁用高压蒸气灭菌；瓶装液体灭菌时，应留有适当排气出口，灭菌完毕后再密闭；耗材灭菌完毕后最菌；瓶装液体灭菌时，应留有适当排气出口，灭菌完毕后再密闭；耗材灭菌完毕后最好烘干。三、试剂的过滤灭菌：承受过滤法除去微生物，适合于对热不稳定的试剂。将待过滤溶液吸入注射器，通过压力使溶液经过过滤器〔内含孔径为0.22-0.4m的过滤膜〕进入无菌容器。104DNA的提取一、试验目的：去除蛋白质、RNA等高分子物质，去除多糖、多酚等次生物质，获得高品质的植物基因组DNA，可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等试验。二、试验原理：十六烷基三甲基溴化胺〔cetyltriethylammoniumbromide,CTAB〕是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中>0.7MCTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后参与异丙醇或乙醇沉淀即可使核酸分别出来。三、试验试剂：2%CTAB提取缓冲液：2%〔w/〕CTA100mMTris-C〔pH8.，20mMEDTpH8.，1.4MNaCl1MTris-C〔pH8.：121.1gTris1L800mlddH2O充分溶解，参与浓盐酸调整至pH8.01L。留意：pH以定容和溶液冷却至室温时为准。3. 186.1gEDTA-Na•2HO1L800mlddHONaOH2 2 2调整至pH8.01L。留意：pH以定容和溶液冷却至室温时为准。4. 氯仿/异戊醇〔24:1,v/v〕5. 无水乙醇6. 75%乙醇7. ddH2O四、试验步骤：2%CATB60℃水浴溶解。取1-2500l2%CATB提取缓冲液。6530min10min轻轻摇动混匀。2min后，参与等体积氯仿-异戊醇，猛烈震荡。10,000rpm10min。2-2.5倍体积无水乙醇，缓慢上下摇动30s混匀。10,000rpm10min，弃尽上清，保存沉淀。70%乙醇清洗沉淀两次。室温下空气晾干沉淀。30-50μlddH2O，定量并电泳检测。五、留意事项：为保证DNA分子的完整性，操作过程中动作要轻柔。2%CTAB提取缓冲液在低于15预热。DNA产物应保存在-20℃，防止反复冻融。附Trizol法提取RNA的流程〔演示：向~100mg1mlTrizol〔Invitrogen〕试剂并重悬。13,000rpm10min，将上清转移到的RNase-free的离心管中。200μl氯仿，充分混匀。13,000rpm10min400μl左右的上清转移到的离心管中。400μl异丙醇，-2010min，沉淀RNA。4℃，13,000rpm10min，弃上清。1ml75%的乙醇，润洗沉淀。13,000rpm5min，弃上清，并吸去残留液体。5-10min，使乙醇挥发干净。50μlRNase-freeddH2O溶解并测定浓度与纯度。DNA的定量一、试验目的：检测DNA的浓度和纯度，为后续DNA分析试验供给依据。二、试验原理：DNA260nm处。当OD260＝1时，dsDNA50μg/ml，ssDNA37μg/ml30μg/ml。当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般状况下同时检测同一样品的OD260、OD280，计算其比值来衡量样品的纯度。纯DNA：OD260/OD280≈1.8〔＞1.9RNA污染；＜1.6，说明有蛋白质、酚等污染。三、试验试剂：DNA样品ddH2O缓冲液四、试验步骤：10min。ddH2O洗涤比色皿，吸水纸吸干。参与溶解样品的缓冲液后，调零。将待测样品适当稀释后，分别测定260nm280nm波长时的OD值。计算待测样品的浓度与纯度。DNA样品纯度：OD260/OD280。DNA样品的浓度〔μg/μl〕=OD260×稀×50/1000注：取样量和稀释倍数由比色皿或仪器类型确定。30μlDNA3mlddH2O；2μlDNA100μlddH2O；Nano-drop2μlDNA溶液直接测定。DNA的电泳一、试验目的：学习和把握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。二、试验原理：琼脂糖凝胶电泳是用于分别、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取DNA在碱性条件下〔pH8.0〕带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动。不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在GoldView〔EB〕电泳检测DNA时，GoldView与核酸结合后能产生很强的荧光信号。三、试验试剂：加样缓冲液0.25%溴酚蓝，40%〔w/v〕蔗糖TAE电泳缓冲液储存液50，1242gTris碱，57.1ml100ml0.5MEDTpH8.〕工作液1：40mMTris1mMEDTpH8.〕Goldview核酸染料基因组DNA或质粒DNA等四、试验步骤：将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。取适量琼脂糖溶解在电泳缓冲液中〔1-25KbDNA1%的凝胶，20-100Kb的DNA用0.5200-2023bp的DNA用1.5的凝胶至完全溶化。将Goldview60〔1l每100ml琼脂糖凝胶。待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内参与电泳缓冲液，然后拔出梳子。将DNA样次序和加样量。安装电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，翻开电源，调整电压，进展电泳。电泳完毕后，取出凝胶，在凝胶成像系统中进展观看和记录。目的基因的PCR扩增一、试验目的：学习和把握聚合酶链式反响的根本原理和应用。二、试验原理：二、试验原理：PCR反响由变性--退火--延长三个根本反响步骤构成：DNA95℃左右确定时间后，使模板DNAPCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响作预备。退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。三、试验试剂：延长：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反响原料，靶序DNA链互补的半保存复制链。重复循环变性--退火--延长三过程，就可获得更多的“半保存复制链”，而且这种链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。三、试验试剂：Taq〔TaKaRaLATaq〕dNTPMixture〔TaKaRa〕引物基因组DNAddH2O四、试验步骤：四、试验步骤：合成的引物在离心机中短暂离心后溶于适量ddH2O100μM的储存液，放置于-2010μM的工作液。在微量离心管中配置以下PCR体系并混匀试剂使用量〔μl〕使用量〔μl〕植物DNA12LATaq0.21dNTP14I0.52IIPCRbuffer〔5x〕ddH2O0.5314.8210放置于PCR仪中按以下程序运行：94℃5min；94℃30sec，55℃1min，72℃1min，30cycle；72℃5min；16℃保温。取出PCR产物，电泳检测。五、留意事项：五、留意事项：引物设计需合理。退火温度需适宜，必要时可结合梯度PCR仪使用。PCR产物的回收

〔参照博迈德多功能DNA纯化回收试剂盒〕获得高质量DN；除去蛋白〔如酶等RN，无机盐NaCl超过150mM对T4有抑制作用，小于100bp的短片段〔如引物DN，有机小分子〔如dNTP等。二、试验原理：在高离序盐存在的状况下，DNA列快速的漂洗－离心的步骤，使用去蛋白液和漂洗液将引物、核苷酸、蛋白酶等杂质去除，最终使用低盐和高pH值的洗脱缓冲液将纯洁DNA从硅基质膜上洗脱。三、试剂盒组成：溶胶/结合液漂洗液洗脱液吸附柱收集管四、操作步骤〔琼脂糖凝胶回收：在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽量切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。DNA1.5ml1.5ml离心管重量，然后放入凝胶块后再称一次，两次重量相减，得到凝胶的重量。3倍体积溶胶/结合液DB〔100mg300μl溶胶液〕。26倍体积溶胶液。5610min〔或直至胶完全溶解2-3min涡旋震荡一次帮助加速溶解。将上一步所得溶液参与吸附柱EC〔吸附柱放入收集管中1mi12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液。参与500μl漂洗液WB〔，12,000rpm离心30se掉废液。500μl漂洗液WB，12,000rpm30sec，弃掉废液。将吸附柱EC放回空收集管中，12,000rpm2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反响。取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μl洗脱缓冲液E〔洗脱缓冲液事先在65-7℃水浴中加热效果更好，室温放置2mi12,000rpm离1min。假设需要较多量DNA，可将得到的溶液重参与吸附柱中，离心1min。〔PCR〕:100μlPCR扩增后体系或者酶切后体系参与500μl溶胶/结合液DB〔假设初始体系小于100μ，请事先用双蒸水调整至100μ。将上一步所得溶液参与吸附柱EC〔吸附柱放入收集管中1mi12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液。从今步骤参见琼脂糖凝胶DNA6-9。DNA线，并且尽可能的缩短紫外线下处理的时间。全部的溶液应当是澄清的，假设环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应当直接使37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。使用前应当恢复到室温。第一次使用前请先在漂洗液WB中参与指定量无水乙醇，参与后请准时打钩标记已参与乙醇，以免屡次参与!溶胶液/结合液中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避开沾染皮肤，眼睛和衣服。假设沾染皮肤、眼睛时，要马上用大量清水或者生理盐水冲洗。pH值≤7.5DNA的效率最高。假设切下来的凝胶中含有电泳缓冲液太多，造成溶胶后溶胶液pH偏高，会导致回收率降低。溶胶后，假设溶胶液照旧保持黄色，说明pH正常；假设变成橘红色或者淡紫色，说明pH偏高，可在胶充分溶解后加5-10μl3M醋酸钠〔pH5.2〕pH5-7〔黄色。洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反响。也可以使用水洗脱，但应当确保pH7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱，DNA片段应当保存在－20℃。DNATE缓冲液洗脱〔10mMTris-HCl，1mMEDT，pH8.，但是EDTA可能影响下游酶切反响，使用时可以适当稀释。14PCRT载体和感受态细胞的转化〔参照TaKaRapMD18-T载体试剂盒和博迈德感受态试剂盒〕一、试验目的：PCR产物的连接和克隆。二、试验原理：T3’端添加了“T”DNA聚合酶进展PCRPCR3’末端添加一个“A”T载体可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。TLacZβ-半乳糖苷酶，在含有IPTG，X-gal的平板培育基上，可进展蓝白斑筛选，选择阳性克隆。大多数T载体供给氨苄青霉素两种筛选标记，有的T载体供给氨苄青霉素和卡那霉素两种筛选标记。三、试验试剂：T载体试剂盒PCR回收产物ddH2O感受态细胞LB培育基固体培育基：10g/LNaCl,10g/L蛋白胨,5g/L酵母提取物,15g/L琼脂粉液体培育基：10g/LNaCl,10g/L蛋白胨,5g/L酵母提取物氨苄青霉素〔Ampicillin,Amp〕储存液：100mg/ml工作液：100μg/ml异丙基硫代半乳糖苷〔Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG〕储存液：100mM工作液：0.5mM5-溴-4-5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷〔5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosideX-Gal〕储存液：20mg/ml工作液：200μl/100mlLB50μl/9cm平板四、试验步骤：试剂使用量〔试剂使用量〔μl〕T载体0.5PCR回收产物适量SolutionⅠ510一般状况下，连接时载体DNA1:2~10。1μlT载体〔50μg〕0.03pmol。PCR产物的使用量〔ng〕=nmolx660xbp数在PCR1630min。室温〔25℃〕>2Kb的PCR产物连1h。中〔一次转化感受态细胞的建议用量为50100μ，置于冰浴中。向感受态细胞悬液中参与连接产物〔DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的格外之一；为防止转化试验不成功，可以保存局部连接反响液，以重转化，将损失降到最低，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰中放置30mi。将离心管置于42℃水浴中放置90sec，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2min，该过程不要摇动离心管。向每个离心管中参与500μl不含抗生素LB培育基，混匀后37℃振荡培育〔150rp，摇床振荡培育45-60mi取适量菌液〔连接产物的转化菌液建议离心重悬于200μlLB液体培育基，取100μl用于涂布；保存剩余的菌液于4℃冰箱中，视平板上菌落生长状况打算去留〕加到含有X-Gal、IPTG、AmpLB固体培育基平板上，用细菌涂布器或玻璃珠将细胞均匀涂开。平板中的液体完全吸取后，倒置平板，37℃培育12-16h。选择白色菌落进展鉴定。五、留意事项PCR产物最好切胶回收，以免杂质影响克隆效率。SolutionⅠ需要在冰中溶解，并避开反复冻融。感受态细胞应保存在-70的转化效率。最好使用颖配置的培育基。菌落〔液〕PCR一、试验目的：检测重组质粒是否成功，外源片段是否正确插入到质粒载体中。二、试验原理：直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进展PCR扩增外源插入片段。三、试验试剂：ddH2OPCRMix〔TaKaRaPremixTaq〕引物LB培育基TAE电泳缓冲液琼脂糖四、试验步骤〔PCR：3l无菌水。为平板上将要挑取的菌落标上号码，用无菌牙签选择单菌落，将菌落转至PCR管中〔牙签在无菌水中洗一下，然后将牙签点在LB平板上，记录号码。试剂使用量〔μl〕PCR试剂使用量〔μl〕PCRMix5I0.5II0.5ddH2O3目的基因PCR扩增。PCR产物电泳检测。五、试验步骤〔PCR：挑起白色单菌落，于含有相应抗生素的1mlLB3-4h。1μl菌液作为PCR反响模板，其余菌液连续培育用于保存。试剂使用量试剂使用量〕菌液1PCRMix5I0.5II0.52目的基因PCR扩增。PCR产物电泳检测。DNA的提取〔参照博迈德质粒小量快速提取试剂盒〕一、试验目的：去除基因组DNADNA，可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR等试验。二、试验原理：承受改进SDS-pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最终低盐、pH值的洗脱缓冲液将纯洁质粒DNA从硅基质膜上洗脱。三、试剂盒组成：RNaseA溶液溶液P1、P2和P3漂洗液洗脱液吸附柱收集管四、试验步骤：挑起白色单菌落，于含有相应抗生素的LB液体培育基中培育8-12h。1ml菌液保存，其余菌液用于提取质粒DNA。1.5-4.5ml过夜培育菌液，9,000rpm30sec，尽可能的倒干上清，收集菌体。250μl溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。250μl的溶液P24-7次使菌体充分裂解。350μl溶液P34-7次，充分混匀时会消灭白色絮状沉淀，13,000rpm5min，留神取上清。将上一步所得上清参与吸附柱AC〔吸附柱放入收集管中，13,000rpm离心sec，倒掉收集管中的废液。参与500μl漂洗液W〔12,000rpm离心弃掉废液。500μl漂洗液WB，12,000rpm30sec，弃掉废液。将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm2min液中残留乙醇抑制下游反响。取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μl洗脱缓冲液E〔洗脱缓冲液事先在65-7℃水浴中加热效果更好，室温放置rpm离心1min。假设需要较多量质粒，可将得到的溶液重参与离心吸附柱中，1min。洗脱体积越大，洗脱效率越高。假设需要质粒浓度较高，可以适当削减洗脱体积，30μl，体积过小降低质粒洗脱效率，削减质粒产量。电泳检测质粒DNA提取结果。五、留意事项：第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNaseA参与溶液P1后〔100μg/ml〕2-8℃保存。环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要猛烈摇摆，以免形成过量的泡沫。溶液P3中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避开沾染皮肤、眼睛和衣服。假设沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。将溶液P3放在冰上预冷，可以提高产量。第一次使用前请先在漂洗液WB在方框打钩标记已参与乙醇，以免屡次参与!洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反响。也可以使用水洗脱，但应当确保pH7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱，DNA片段应当20℃。DNA片段假设需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱〔10mMTris-HC1mME