工程合成生物构建技术

工程合成生物构建技术第一页，共八十页，编辑于2023年，星期六现代制药工艺学-生物制药部分的基本要求(1)了解前沿进展(2)掌握基本原理和技术(3)能设计相关工艺实验研究的技术方案(4)重点掌握授课内容(5)下载相关文献,掌握其中核心知识和技术第二页，共八十页，编辑于2023年，星期六主要内容第一讲工程生物的构建原理与技术第二讲青蒿素前体的合成生物技术第三讲重组人干扰素产品创新与工艺研究第三页，共八十页，编辑于2023年，星期六工程生物engineeredorganisms通过基因工程、转基因、合成生物学等工程技术创造的生物重组微生物，合成微生物转基因植物转基因动物工程生物第四页，共八十页，编辑于2023年，星期六1998-2002年，欧盟第五框架计划实施细胞工厂(cellfactory)项目，其目的是全面了解应用微生物。美国：生物学角度，最小基因组(minimizedgenome)是由一套生物生存必需的最小基因组成。日本：2001年，从工业应用角度，具有最小基因组的工业微生物就是最小基因组工厂（minimizedgenomefactory）。最小基因组工厂是具有工业生产必需基因，而非必需基因和有害基因已经被删除的微生物。它不仅简单，而且是又容易工业过程控制。2002年创办国际刊物《MicrobialCellFactories》，报道微生物细胞作为重组蛋白、天然产物的生产者，或生物转化的催化剂等方面的研究进展和论文。中国：2010年以后，人工细胞工厂，人工生物体系，人工生物系统最小基因组工厂第五页，共八十页，编辑于2023年，星期六继人类基因组研究之后，生物领域一热门学科，是整体系统论生物学思潮在工程学领域的再现。

合成生物学（syntheticbiology）的概念合成生物学按照人类的目的设计并创造新的生命元件器件，功能模块乃至自然界不存在的生命系统;对现有的生命体进行有意义的工程改造，赋予其新的功能。合成生物学的核心思想是，认为生命的所有元件都能由化学方法来合成制造，并进而通过工程化方式组装成实用的生物体。第六页，共八十页，编辑于2023年，星期六1911：《柳叶刀》，出现“合成生物学”2000年以后，迅速发展，注意力转向该领域2004年（MIT）Technology

Review，合成生物学评为“将改变世界的十大新技术”之一2004年开始，全球iGEM比赛（大学生遗传机器作品）2004年6月：MIT，第1届合成生物学国际会议(SB1.0)2005年5月：UC伯克利,SB2.0；2007年6月，瑞士，SB3.02008年10月：香港，SB4.0；2011年6月:StanfordU,SB5.02013年7月，英国伦敦，SB6.02012年，ACSSyntheticBiology合成生物学的学术交流合成生物学

概述第七页，共八十页，编辑于2023年，星期六2002年Cello等合成脊髓灰质炎病毒的cDNA（Science,

2002，297：1016-1018），2005年Endy等合成噬菌体T7基因组（MolSystemsBiology，2005，1：1-10）2007年CraigJ.Venter研究所（CJVI）实现了基因组的物种间人工移植（Science，2007，317:632-638）2008年该所人工全合成了生殖衣原体细菌基因组（Science,2008，319：1215-1220）2009年利用酵母对克隆的基因组进行工程化组装（Science,2009，325:1693-1696），2010年CJVI合成活细菌2011年合成酵母染色体臂2014年，合成酵母III号染色体基因组合成的技术发展第八页，共八十页，编辑于2023年，星期六从头合成DNA的里程碑事件1955,二聚体dTdT(2nt)1968,酵母丙氨酸转移RNA(77nt)1981,人干扰素a(514bp)2002,脊髓灰质炎病毒(7501bp)2004,6脱氧红霉素内酯B合成酶基因簇DEBS(31656bp)2008,支原体基因组(582970bp)2010,支原体细菌2014，酵母染色体基因组工程基因组合成基因合成第九页，共八十页，编辑于2023年，星期六合成生物学合成生物的单元合成生物的设计与优化生物元器件生物元器件第十页，共八十页，编辑于2023年，星期六类型计算机生命系统system全局全球网生命体局部局域网组织或器官个体单台细胞器件devices芯片基因组，复制/转录/翻译装置功能单元模块代谢途径元件parts电子元件生物元件合成生物学与计算机工程的层阶比较

合成生物学第十一页，共八十页，编辑于2023年，星期六1、基因元件基因（生物）元件：具有某种特定的生物学功能的DNA，是设计和合成生物的基本单位。特性：信号接受和输入功能，信号发送和产物输出功能，调节信息流、代谢和生物合成的功能，和其他元件相互作用，具有特定的工作环境。功能元件：编码1个/组生化反应酶功能基因/基因簇；编码组成细胞组分蛋白质的基因界面调控元件:包括功能基因转录、蛋白质翻译与修饰、功能酶反应等的调控基因。合成生物的单元合成生物学生物元器件第十二页，共八十页，编辑于2023年，星期六基因元件的图形编码-制图复制子

启动子

阻遏子

诱导子

终止子

RBS

功能基因

MCS

抗性

合成生物学生物元器件基因（生物）元件：具有某种特定的生物学功能的DNA，是设计和合成生物的基本单位。第十三页，共八十页，编辑于2023年，星期六生物部件：由一个或多个基因元件组成最简单的能行使催化功能的生物部件是完整的编码酶基因表达盒。启动区功能基因终止区合成生物学生物元器件第十四页，共八十页，编辑于2023年，星期六生物模块是一组细胞内区域化的生物部件，由内在功能联系在一起，执行特定的复杂功能。如代谢途径、信号转导途径、调控途径等。模块：通过某种（逻辑/功能）关系把生物元件连接而成与电子科学中的电路类似，在合成生物学，不同功能的生物砖联接后，能像电路一样运行，形象地称为基因线路（geneticcircuit）。按功能分为:代谢线路,调控线路,信号线路等生物模块与基因电路合成生物学生物元器件第十五页，共八十页，编辑于2023年，星期六EndyD提出了合成生物学设计的工程策略：标准化、解耦联和抽提。标准化：确立基本生物元件的方法、对生物功能的定义和特征描述。解耦联：复杂系统解分成具有独立功能的简单组分。抽提：建立元件和模块的层阶。合成生物的设计与优化合成生物学生物元器件第十六页，共八十页，编辑于2023年，星期六抽提：一个反应对应一个酶，一个酶对应一个基因。功能模式：基因表达调控的操纵子模型。优化：功能基因密码子、启动子、核糖体结合位点。适合于不同宿主表达的生物元件。1、生物元件的设计与优化合成生物学生物元器件第十七页，共八十页，编辑于2023年，星期六生物砖构建基因电路的困难是，把相同功能的不同生物来源的生物砖集成基因电路后，不一定具有功能。优化方法可以是基于数学模拟的理性设计，也可以是生物元件的直接进化。2.基因电路的设计与优化合成生物学生物元器件第十八页，共八十页，编辑于2023年，星期六iGEM（InternationalGeneticallyEngineeredMachine）竞赛，在美国麻省工学院（MIT）收集每年参赛者贡献的生物元器件，建立了标准生物元件库（RegistryofStandardBiologicalParts）()。经过10年的收集，该文库的元器件以BBa为字头，容量已达到约2万个。生物元件库合成与装配第十九页，共八十页，编辑于2023年，星期六数据库RegulonDB中，大肠杆菌天然操纵基因中有1000余个启动子，及其他功能元件序列。数据库BIOFAB（InternationalOpenFacilityAdvancingBiotechnology，/data）有数千个人工合成并表征的启动子、核糖体结合位点等元件。天津大学生物信息学中心建有必需基因数据库（/deg），包括大肠杆菌、芽孢杆菌、结核杆菌等31种原核生物，人、小鼠、线虫、果蝇、酵母、拟南芥等10余种真核生物。生物元件库合成与装配第二十页，共八十页，编辑于2023年，星期六合成生物学的研究与应用第二十一页，共八十页，编辑于2023年，星期六自然细胞基因组（庞大）人工细胞细胞网络（松散）genegeneRNAprotein目标产物细胞工厂（低效）细胞网络（紧凑）人工细胞工厂（高效,新功能）RNAprotein目标产物genegene功能模块合成简化解耦ATCG…合成生物学的研究思路底盘细胞能源/药物底盘构建重构自然细胞新功能/用途人工合成新生物系统模块设计ABCDEFG抽提第二十二页，共八十页，编辑于2023年，星期六工程生物构建的基本过程基因元件设计基因线路合成制药工程生物功能底盘细胞遗传转化底盘细胞设计基因组编辑基因元件合成适配性筛选氨基酸，维生素，抗生素，抗癌药物，聚酮，萜类等第二十三页，共八十页，编辑于2023年，星期六第一讲工程生物的构建原理与技术DNA体外重组技术/基因工程生物元件的组装技术/元件工程基因组的编辑技术/基因组工程第二十四页，共八十页，编辑于2023年，星期六体外重组是把不同来源的DNA分子用特异性酶切割，然后将两者连接成杂合分子。体外重组的两大工具:核酸限制性内切酶和连接酶，如同剪刀和胶水。DNA片段1DNA片段2

酶切可连接的片段

载体重组DNA分子

连接酶DNA元件的体外重组第二十五页，共八十页，编辑于2023年，星期六基因的体外重组基因重组示意图第二十六页，共八十页，编辑于2023年，星期六载体/质粒酶：限制性内切酶，连接酶，聚合酶DNA体外重组工具第二十七页，共八十页，编辑于2023年，星期六基因元件载体载体kb容量kb宿主导入方式复制子质粒载体3-55-10Ec转化ColE1λ噬菌体30-447-23Ec转导ColE1黏粒5-830-45Ec转导ColE1P13070-100Ec转导P1PAC20130-150Ec电转化P1BAC7-9120-300Ec电转化FYAC10-15250-2000Yeast转化ARS载体/质粒Vector：基因的携带者第二十八页，共八十页，编辑于2023年，星期六复制起始点选择标记多克隆位点质粒载体基因元件的载体1.结构第二十九页，共八十页，编辑于2023年，星期六自主复制性:复制起始点以及控制复制频率的调控基因。不相容性:具有相同或相似复制子结构及特征的的质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内。转移性：从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞。选择标记：抗生素抗性基因等。表达功能:能转录、翻译合成外源基因的产物。基因元件的载体2.质粒的特性第三十页，共八十页，编辑于2023年，星期六克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。测序质粒：用于基因测序。整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合。穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在。表达质粒：能表达基因产物。基因元件的载体3.质粒的类型第三十一页，共八十页，编辑于2023年，星期六噬菌粒载体：由丝状噬菌体DNA复制起始位点序列与质粒组成的杂合分子。M13噬菌体间隔区克隆到质粒上，形成噬菌粒。特点：象质粒一样，自主复制而稳定遗传。象噬菌体一样，包装成颗粒，分泌胞外。基因在M13载体和质粒载体之间的转移。激活过程：辅助丝状噬菌体感染带有噬菌粒的受体细胞，反式激活噬菌粒上的间隔区位点，启动噬菌粒以丝状噬菌体DNA的复制模式进行复制。分别包装成颗粒并分泌到受体细胞外。基因元件的载体噬菌粒载体第三十二页，共八十页，编辑于2023年，星期六含有噬菌体f1间隔区的载体：pBS，pGEM11Zf，pBluescript。基因元件的载体第三十三页，共八十页，编辑于2023年，星期六由λDNA的cos区与质粒DNA重组而成，主要用于基因文库的构建。λDNAcos位点及其附近区域的DNA片段为1.7kb质粒DNA为3.3kb构成的黏粒总共5kb最大装载量达45kb基因元件的载体黏粒载体，考斯质粒第三十四页，共八十页，编辑于2023年，星期六大肠杆菌-哺乳动物细胞穿梭载体第三十五页，共八十页，编辑于2023年，星期六pUC复制子，ΦC31

整合酶，位点特异性整合在链霉菌基因组的att位点

oriT

大肠杆菌与链霉菌接合转移aac3(IV)

安普抗性基因，大肠杆菌和链霉菌中筛选标记BamHI克隆位点：天然产物生物合成基因簇大肠杆菌-链霉菌穿梭载体第三十六页，共八十页，编辑于2023年，星期六pRS313,大肠杆菌-酵母穿梭载体酵母复制子大肠杆菌筛选标记大肠杆菌复制子酵母筛选标记多克隆位点第三十七页，共八十页，编辑于2023年，星期六大肠杆菌-链霉菌-酵母穿梭载体第三十八页，共八十页，编辑于2023年，星期六大肠杆菌-棒杆菌穿梭载体KanR，可移动整合表达载体游离表达载体第三十九页，共八十页，编辑于2023年，星期六概念：在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。种类：I类限制性内切酶：识别位点和切点不同，切断部位不定。II类限制性内切酶：严格识别,特异性切割。III类限制性内切酶：特异性切割，识别部位和切点不同。1.概念与种类限制性核酸内切酶第四十页，共八十页，编辑于2023年，星期六基本名称：生物拉丁文名称属名的第一个大写字母和种名的前两各小写字母缩写构成（斜体）。如果酶存在于一种菌株中，加株名的一个大写字母。如果酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，用一个大写字母表示这些非染色体的遗传物质。酶名称的最后部分为罗马数字，表示该生物体中发现此酶的先后次序。举例：HindⅢ，Haemophilusinfluenzaed株中发现第三个酶。2.Ⅱ类限制性核酸内切酶的命名规则基因的体外重组第四十一页，共八十页，编辑于2023年，星期六4、5或6个碱基对，而且具有180°旋转对称的回文结构。EcoRI的识别序列为：5′—GAATTC—3′3′—CTTAAG—5′有些酶切割后产生平末端,大部分酶切割后产生黏末端，5′或3′突出末端。3.内切酶的识别序列基因的体外重组第四十二页，共八十页，编辑于2023年，星期六EcoRⅠ酶切后形成5′突出端

EcoRⅤ酶切后形成平末端

PstⅠ酶切后形成3′突出端

基因的体外重组第四十三页，共八十页，编辑于2023年，星期六活性单位（1U）定义：为50μl反应体系中，特定温度下经过1小时反应，完全分解1μgDNA所需酶量。甲基化：从带有DNA甲基化酶基因的宿主中分离制备DNA，其碱基一部分被甲基化，影响酶识别和切割能力，甚至不能切割。星号活性：限制性酶对底物的特异性降低，导致切割非特异识别位点，电泳弥散（smear）。尽可能降低甘油浓度，在中性pH和高盐离子浓度下进行酶切反应。4.影响酶切的因素基因的体外重组第四十四页，共八十页，编辑于2023年，星期六缓冲液与温度：每种酶都有最适反应缓冲液，应在最佳工作温度下和反应缓冲液中进行。酶量与反应时间：增加酶量，相应缩短时间。质粒纯度不很高，酶切反应通常在数倍过量酶的条件下进行。基因的体外重组4.影响酶切的因素第四十五页，共八十页，编辑于2023年，星期六DNA连接酶催化的基本反应:DNA双链上相邻的3′羟基和5′磷酸基因共价结合形成3′—5′磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来。T4噬菌体的DNA连接酶:以ATP作为辅助因子，它在与酶形成复合物的同时释放出焦磷酸基团。大肠杆菌DNA连接酶:以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）作为辅助因子。活化后的酶复合物结合在DNA的缺口处，修复磷酸二酯键，并释放AMP。T4-DNA连接酶比大肠杆菌连接酶具有更广泛底物适应性。连接反应与连接酶基因的体外重组第四十六页，共八十页，编辑于2023年，星期六基因的体外重组DNA连接酶的各种特性连接酶平端/℃突端/℃切口补平/℃T4DNA连接酶15-25437大肠杆菌DNA连接酶—10-1537热稳定性DNA连接酶—24-3765-72第四十七页，共八十页，编辑于2023年，星期六DNA/RNA聚合酶：催化合成DNA/RNA分子的酶。体外进行聚合反应与体内相似，一般需要模板，合成产物为模板的互补序列。根据聚合酶依赖的模板，可分为：依赖于DNA的DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段、T4和T7DNA聚合酶及热稳定性DNA聚合酶；用于DNA复制和扩增依赖于DNA的RNA聚合酶：转录酶，基因的转录依赖于RNA的DNA聚合酶：反转录酶，病毒的复制不依赖于模板的聚合酶：把核苷酸加到DNA分子的末端，即末端转移酶。四、DNA聚合反应与聚合酶基因的体外重组第四十八页，共八十页，编辑于2023年，星期六各种聚合酶特性基因的体外重组酶温度℃模板聚合活性外切活性大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ16-22ssDNA,ssRNA5→35→33→5Klenow片段16-22ssDNA,ssRNA5→33→5T4DNA聚合酶37ssDNA5→33→5末端转移酶37dsDNA5→3无多核苷酸聚合酶37ssRNA5→3无T7RNA聚合酶37dsDNA5→3无SP6RNA聚合酶40dsDNA5→3无第四十九页，共八十页，编辑于2023年，星期六5′→3′外切活性3′→5′外切活性5′→3′聚合活性5′→3′聚合活性3′→5′外切活性

5′→3′外切活性基因的体外重组聚合酶活性第五十页，共八十页，编辑于2023年，星期六大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段Klenow酶用途：1）3’凹端补平，使之成为平末端；2）对DNA片段进行标记，合成探针；3）用于催化cDNA第二链的合成；4）用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列。T4-DNA聚合酶：修平非平头的cDNA分子以及由某些限制性核酸内切酶水解产生的3’突出末端。

基因的体外重组聚合酶的用途Klenow酶第五十一页，共八十页，编辑于2023年，星期六末端转移酶：转移活性比其他聚合酶高，用于RT和PCR反应物、载体末端加同聚物和3末端标记反应。多核苷酸聚合酶：用于RNA3标记和加poly(A)。RNA聚合酶：可用于合成RNA探针、体外翻译，可用T7转录系统在大肠杆菌、酵母中表达外源基因。基因的体外重组聚合酶的用途末端转移酶第五十二页，共八十页，编辑于2023年，星期六碱性磷酸酶来源于大肠杆菌和牛小肠。细菌碱性磷酸单酯酶和牛小肠碱性磷酸单酯酶（CIAP）均能催化DNA、RNA核苷酸的5′端单酯水解，除去磷酸，需要辅基Zn2＋，但不能催化磷酸二酯和三酯的水解。在DNA重组实验中，该酶用于载体DNA的5′末端除磷操作，以提高重组效率。外源DNA片段的5′端除磷磷酸基，则可有效防止外源DNA片段之间的连接，提高重组效率。在核酸5′末端标记前，用碱性磷酸酶除去磷酸，可得到较高的标记效率。基因的体外重组聚合酶的用途碱性磷酸酶第五十三页，共八十页，编辑于2023年，星期六基因的体外重组聚合酶的用途其他酶核酸酶模板用途核糖核酸酶HDNA/RNAcDNA克隆、除去mRNApoly(A)末端。核糖核酸酶ARNA除去质粒或DAN-RNA、RNA-RNA杂合体中未杂交的单链RNA，突变检测S1核酸酶ssRNA,ssDNAS1作图，dsDNA末端平化，除去DNA－DNA和RNA－DNA杂交体中的单链部分绿豆核酸酶ssRNA/ssDNA杂交作图，双链DNA末端平化外切酶IIIdsDNA测序，DNA缺失，DNA－蛋白质相互作用分析脱氧核糖核酸酶IssDNAdsDNA体外转录后除去模板DNA，切口平移反应，DNA－蛋白质相互作用分析，降解RNA中的DNA第五十四页，共八十页，编辑于2023年，星期六PCR(Polymerasechainreaction,PCR)：聚合酶链式反应，是由DNA聚合酶催化下，对特定的DNA序列进行的复制反应。本质：根据生物体的DNA复制原理在体外合成基因。发明者：Mullis，1983年，生物技术革命性象征。PCR及其衍生技术-目标基因组装一、PCR技术目标基因组装第五十五页，共八十页，编辑于2023年，星期六(2)退火（55℃）(4)完成一个循环(3)延伸（72℃）

目标基因扩增(1)变性（94℃）1.PCR单反应原理与过程第五十六页，共八十页，编辑于2023年，星期六产物计算：Yn＝Y0（1＋X）n其中Yn为n循环后的拷贝数，Y0为起始拷贝数，X为扩增效率，n为循环数。

2.PCR循环目标基因扩增第五十七页，共八十页，编辑于2023年，星期六模板DNA：目标序列,100－10000bp,pg引物：两条寡核苷酸。脱氧核苷酸：4种dNTP,即dATP,dCTP,dGTP,dTTPDNA聚合酶:Taq聚合酶，耐高温缓冲溶液：50mMKCl、10mMTris－HCl,1.5mMMgCl23.PCR扩增的反应体系组成目标基因组装第五十八页，共八十页，编辑于2023年，星期六长度：20～30bp，与模板配对长度18～25bp。GC含量:40～60％，4种碱基分布均匀。Tm值计算:15～20bp，Tm＝2（A＋T）＋4（C＋G）。

14～40bp：Tm＝81.5℃＋16.6(lg[K+])＋0.41([G+C]%)引物Tm之差不能大于5℃，产物Tm值与引物Tm值之差不能低于10℃。一般在50℃～65℃之间，温度越高特异性越强。4.PCR操作指南——引物设计目标基因扩增第五十九页，共八十页，编辑于2023年，星期六酶识别序列碱基对数0123ApaIGGGCC↓C－－±＋BamHIG↓GATCC－±＋＋ClaIA↓TCGAT－±＋＋EcoRIG↓AATTC－±＋＋EcoRVGAT↓TAC－＋＋＋HindIIIA↓AGCTT－－－＋NotIG↓CGGCCGC－－＋＋PstICTGCA↓G－－±＋SacIGAGCT↓C－±＋＋SalIG↓TCGAC＋＋＋＋SmaICCC↓GGG－±＋＋SpeIA↓CTAGT＋

XbaIT↓CTAGA－±＋＋XhoIC↓TCGAG－－±＋4.PCR操作指南——酶切位点设计目标基因扩增第六十页，共八十页，编辑于2023年，星期六聚合酶外切活性温度℃稳定性错误率×10－6Taq

5→375～8097.5℃,9min20～100rTth5→375～8097.5℃,20min20Tbr5→375～8096℃,150min－Pwo3→560～65100℃,2hr－DeepVent3→570～80100℃,480min20～45Pfu3→572～7895℃,240min1.6Tli3→570～80100℃,100min20～45Tfl

07070℃,120min100Taqstoffel075～8097.5℃,21min504.PCR操作指南——DNA聚合酶的选择目标基因扩增第六十一页，共八十页，编辑于2023年，星期六Mg离子浓度：1.5~5.0mM。退火温度：根据产物基因的Tm值和长度计算。退火时间：一般30秒至2分钟，根据长度计算。延伸时间：一般1－3分钟。循环次数：25－40次，根据模板含量。PCR反应应该包括正、负对照，无模板、无引物、无聚合酶等对照，以便检测PCR的进行和结果分析。整个过程在PCR仪内，编程后自动完成。4.PCR操作指南——循环参数设计目标基因扩增第六十二页，共八十页，编辑于2023年，星期六常规操作：冷启动，在冰上把反应物混合后，设计最佳程序，直接进行。热启动操作：先把引物和模板混合并加热到高于非特异性结合温度，加入聚合酶，启动PCR。降序操作：PCR过程优化的最佳选择。前两个扩增循环的复性温度比富含GC引物与模板完全配对的熔链温度高3℃。随后的循环中，复性温度逐渐降低1℃。总有一个温度点是特异性扩增的温度。用于兼并引物、模板DNA序列复杂和进行多重PCR。降低非特异性扩增。5.PCR操作方式目标基因扩增第六十三页，共八十页，编辑于2023年，星期六反转录PCR（ReverseTranscriptionPCR,RT‑PCR）:以mRNA为起始材料，通过反转录酶合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成DNA片段。应用：克隆基因的末端序列、表达的功能区段检测基因表达和诊断遗传病和感染的病毒等二、反转录PCR技术目标基因扩增第六十四页，共八十页，编辑于2023年，星期六第一步:反转录反应第二步:PCR扩增反应1.RT－PCR原理与过程目标基因扩增第六十五页，共八十页，编辑于2023年，星期六2.RT反应体系的组成目标基因扩增成分浓度用量mRNA1pg～100ng缓冲液10×2μl4种dNTPs混合液20mmol/L1μl引物5～20pmol/L1μlRNase抑制剂20U1μlMgCl250mmol/L1μl反转录酶100～200U1μlH2O13μl总体积20μl第六十六页，共八十页，编辑于2023年，星期六3.反转录酶特性与选择目标基因扩增酶温度℃模板聚合活性RNaseH产物AMV41-45ssRNA,ssDNA5→3强短MMLV37ssRNA,ssDNA5→3弱或无长第六十七页，共八十页，编辑于2023年，星期六（1）样品变性。75℃变性RNA5分钟，冰上冷却。（2）反转录。加入其他成分，混合。在42℃或37℃下，合成cDNA第一链，一般1小时。（3）终止反应。95℃加热5分钟，使反转录酶失活。设置相关的正负对照，便于监测反应过程和分析反应结果。反转录之后，对产物稀释至一定倍数，然后作为模板，建立PCR反应体系，进行PCR扩增。4.RT反应操作目标基因扩增第六十八页，共八十页，编辑于2023年，星期六溶菌酶和SDS处理:破裂细胞后，释放出内容物。碱变性:蛋白质、细菌染色体和质粒都发生变性。蛋白质、细胞壁碎片和染色体DNA相互缠绕形成大型复合物，被SDS包裹。酸中和：加入乙酸钾，使碱性溶液至中性，染色体分子巨大，无法复性，质粒很快复性,进入上清液SDS包裹蛋白质、染色体及细胞碎片被沉淀下来。离心:除去蛋白质、染色体DNA及细胞碎片等沉淀，质粒保留在上清，最后用乙醇或异丙醇沉淀。质粒载体的分离与纯化原理1.SDS碱裂解制备提取质粒的原理基因的体外重组第六十九页，共八十页，编辑于2023年，星期六去污剂：TritonX100煮沸加热：使细胞壁裂解，同时使蛋白质、核酸等变性沉淀。降低温度：冰浴迅速降温，质粒得以复性，其他生物大分子不能有效复性.离心:除去杂质，收集质粒。加热裂解制备提取质粒的原理:基因的体外重组第七十页，共八十页，编辑于2023年，星期六质粒大小：大于15kb，温和的SDS碱法提取，操作过程也要尽量轻柔，避免质粒被机械剪切而断裂。小于10kb的质粒可用剧烈的加热裂解法提取。碱或加热处理时间：对提取质粒的质量影响很大，时间延长会使质粒不可逆变性，应注意避免。除去RNA：由于含有大量的RNA，要用RNaseA处理。RNaseA可在第一步加入，节省时间。溶菌酶：小量提取，不加溶菌酶。大量提取时添加7％溶菌酶，并给予一定时间处理。注意事项基因的体外重组第七十一页，共八十页，编辑于2023年，星期六质粒的电泳检查：2～3带：2～3种螺旋构型质粒的电泳速率不同最亮带：负超螺旋质粒中间带：缺口开环质粒滞后带：两条链都断裂的线