固相微萃取条件优化及发酵菜粕风味物质分析论文

固相微萃取条件优化及发酵菜粕风味物质分析摘要旨在研究固相微萃取与气质联用研究发酵菜粕的风味物质及比较不同品种菜粕发酵前后风味物质的变化，以峰面积及峰数为指标，通过萃取头、萃取温度、吸附时间和样品量的优化，确定了固相微萃取和气质联用研究发酵菜粕风味固相微萃取的条件，并比较了3种代表性菜粕发酵前后风味物质及硫苷组分和含量的变化。结果表明：固相微萃取最佳条件是：50/30µmDVB/CAR/PDMS(DCP)萃取头，温度70℃，吸附30min，样品量2g，其中萃取头和吸附温度显著影响萃取效率。发酵前后菜粕的挥发性组分及含量变化都较大，发酵后风味物质的总量都显著增加，硫苷的含量明显降低，表明发酵不但显著增加了风味物质的含量改变了风味，而显著降低了抗营养物质硫苷的含量。关键词发酵菜粕固相微萃取风味物质气质联用Optimizationofsolidphasemicroextraction(SPME)andanalysisofvolatilecompoundsinfermentedrapeseedmealDuJing1NiuYanxing2*ZhouQi3ZhangNannan3LiKunpeng3(CollegeofBiologicalandFoodEngineeringHuaihuaUniversityKeyLaboratoryofResearchandUtilizationofEthnomedicinalPlantResourcesofHunanProvince1,Huaihua418000)(CollegeofFoodScienceHainanUniversity2,Haikou570228)(OilCropsResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalSciencesHubeiKeyLaboratoryofOilcropsLipidChemistryandNutrition3,Wuhan430062)AbstractTheobjectiveofthisstudywastoinvestigatetheoptimizationofsolidphasemicroextraction(SPME)conditionsforfermentedrapeseedmealandcomparethemajorvolatilecompoundsandglucosinolateofthreecultivarsrapeseedmealandfermentedrapeseedmeal.TheeffectsoftypeofSPMEfiber,adsorptiontemperature,adsorptiontimeandsampleamountwerestudiedtodevelopSPMEconditionsforobtainingthehighestextractionefficiency.TheresultsshowedthatoptimalconditionswereSPMEfiber50/30µmDVB/CAR/PDMS(DCP),adsorptiontemperature70°C,adsorptiontime20minandsampleamount2g.Theextractionefficiencysignificantlyincreasedwiththeincreasedofadsorptiontemperature.Thespeciesandamountofglucosinolateoffermentedrapeseedmealweresignificantlylowerthanrapeseedmeal,thusmicrobialfermentationnotonlyimprovedthefavorofrapeseedmeal,butalsodecreasedthecontentofglucosinolate.KeywordsFermentedrapeseed,solidphasemicroextraction,volatilecompounds,gaschromatographymassspectrometry油菜是十字花科草本植物，是世界第三大植物油的来源[1]，也是我国重要的油料作物之一[2]。据FAO统计，2013年全世界油菜种植总面积3637万公顷，油菜籽总产量7253万吨，其中我国油菜籽总产量为1440万吨[3]。油菜籽是高含油量的油料，含油率达到38%-50%。油菜籽中含有合理均衡的碳水化合物和蛋白质，其中蛋白含量约为25%～30%，还含有少量的维生素，矿物质和抗营养成分如硫苷和植酸等[4]。菜籽油是优质植物油，不仅可用作食用油，而且可用于生产生物柴油。菜粕是菜籽提取油脂后的产品，目前主要用作动物饲料和肥料。菜粕中蛋白含量约34%～38%，氨基酸组成合理均衡，是良好的蛋白质来源；粗纤维含量在14%以下，并含有酚类和其他生物活性化合物如维生素E、维生素B、胆碱和矿物质如钙、镁、锌和铜[5,6]，不仅可饲用，而且是良好的食用蛋白源。但由于菜粕含有硫苷、异硫氰酸酯、单宁、植酸、芥酸等抗营养因子[6]，大大限制了其有效利用。微生物发酵能显著降低硫苷含量，是提高菜粕品质比较有效的方法[7]。研究表明菜粕在固态发酵过程中不但硫苷含量降低而且产生了改善菜粕风味的组分[8]。通过固相微萃取和气质联用法，不但能分析菜粕在发酵过程中产生的风味物质及其含量而且能分析发酵菜粕中某些抗营养因子硫苷的降解情况，然而相关研究较少。钮琰星等用固相微萃取和气质联用研究了菜粕经固态发酵之后风味的变化[8]，对固态发酵菜粕风味物质分析的固相微萃取条件的相关研究及不同品种菜粕发酵前后风味组分和硫苷含量的变化还未见报道。本试验研究了固相微萃取条件对菜粕风味物质测定的影响，并比较了3种菜粕固态发酵前后菜粕风味物质和硫苷的含量及组分变化，旨在为发酵菜粕风味物质及相关成分的研究提供参考和依据，为菜粕去毒方法的选择及高品质发酵菜粕的制备提供理论指导。材料与方法1.1材料与试剂3种菜粕：新疆、四川、中双11，分别为高、中、低硫苷的代表。发酵菜粕：菜粕/麸皮为7︰3，K2HPO4·3H2O0.5g/kg，MgSO4·7H2O0.5g/kg，含水量60%，接种量5%，28℃培养5d后70℃真空干燥至恒重。接种菌株为Bacillussubtilis3-10，种子液用LB培养基培养16h，得到发酵菜粕。2-戊酮(色谱纯)美国sigma公司；芥子酶美国sigma公司；丙烯基硫苷葡萄糖苷(色谱纯)美国sigma公司；乙腈(色谱纯)上海安谱科学仪器有限公司。1.2仪器与设备6890N-5975气相色谱-质谱联用仪和DB-Wax毛细管柱(30m×0.25mmi.d,0.25µm)美国安捷伦公司；萃取头（50/30µmDVB/CAR/PDMS(DCP)，100µmPDMS，85µmpolyacrylate(PA)）上海安谱科学仪器有限公司；LC-6AD液相色谱日本岛津。1.3方法1.3.1气质联用检测方法取一定量的样品于10mL萃取瓶中，加入5µL内标2-戊酮[11]和磁力搅拌转子，迅速密封后置于设定温度的磁力搅拌器水浴中，搅拌平衡一段时间后，将萃取头插入样品瓶中，吸附一定的时间后将萃取头插入到气质联用仪的进样口，230℃条件下，解析5min。色谱条件：色谱柱DB-Wax毛细管柱(30m×0.25mmi.d,0.25µm)；升温程序为40℃保持4min，以5℃/min升温至230℃，保持10min；载气(99.999%He)流速1mL/min，进样量1µL；不分流。质谱条件：四极杆温度150℃；离子源温度130℃；质量扫描范围m/z50～350。风味物质含量计算[9,10]1.3.2单因素试验的四个因素及各个水平如表1[12]所示，以风味物质的峰面积、峰数两个评价指标综合分析，确定最佳萃取条件。表1固相微萃取试验因素和水平表因素水平萃取头DCP,PDMS萃取温度/℃40,50,60,70,80萃取时间/min10,20,30,40,50样品量/g1,1.5,2,2.5,31.3.3硫苷含量测定参考HPLC法测定油菜籽中硫苷葡萄糖甙含量的方法(标准号ISO9167-1:1992(E))[13]。结果与分析2.1 萃取头的选择本文选择3个较常用的具有不同极性的萃取头（PA极性，PDMS非极性和DCP中等极性）研究萃取头对萃取效果的影响，结果如图1。由图1知，萃取头的材料显著影响萃取的效率。其中中等极性DCP萃取的风味物质的总峰面积显著的高于极性PA和非极性PDMS的萃取头。对发酵菜粕风味物质贡献率最大的是吡嗪类，其中四甲基吡嗪的贡献率最大，其次是腈类。DCP萃取头萃取到8种吡嗪类和3种腈类；PDMS萃取到8种吡嗪类和2种腈类；PA萃取到5种吡嗪类和2种腈类。从萃取风味物质组分的总数来看，DCP，PDMS和PA分别吸附了36，29和26个组分，所以选择DCP萃取发酵菜粕中的风味物质。图1萃取头对风味物质总峰面积的影响2.2 萃取温度的确定萃取温度是影响固相微萃取效果的一个重要因素，升高萃取温度，挥发性组分的分散速度增加，有助于其从样品中释放到顶空，增加挥发性组分的蒸汽压[14]，且加强了固相和气相的对流，而提高萃取效率。但温度升高，挥发性组分的分配系数[15]和萃取头的吸附能力降低[12]，且高温下有些挥发性组分发生降解，所以不宜选择过高的萃取温度。由图2可看出，随温度的增加，挥发性组分的总峰面积、吡嗪类和腈类物质的峰面积都增加，但70和80℃之间峰面积没有显著性差异。随温度的增加，多数组分如腈类、吡嗪类、烃类的峰面积百分比增加，但醇类和酸类等组分峰面积百分比减小。这是由于挥发性组分间的竞争吸附[16]。随温度的增加萃取头吸附的吡嗪类的峰数有增加的趋势。随温度的升高，40～60℃总峰数从26增加到35个，70～80℃总峰数减少，综合考虑最终选择70℃为最佳萃取温度。图2萃取温度对发酵菜粕风味物质总峰面积、腈类物质和吡嗪类物质峰面积的影响2.3 吸附时间的确定图3吸附时间对发酵菜粕风味物质组分总峰面积的影响萃取时间影响挥发性组分吸附平衡的到达[17]。由图3可知，随萃取时间的增加，总峰面积增加，但增加不显著，从增加速率来看，30～50min，随时间的增加，峰面积增加速率减小，这是因为吸附的开始阶段，挥发性组分很容易吸附到萃取头的固定相涂层上，因此风味物质浓度增加很快，随萃取时间的延长吸附速率逐渐降低而接近吸附平衡[18]。综合考虑选择30min为最佳的吸附时间。这与NataliaCampillo等[19]研究啤酒中的挥发性组分的结果一致。2.4 样品量的确定样品量会影响顶空容积进而影响平衡时顶空中样品的浓度[20]。由图4可看出，随样品量的增加，风味物质的总峰面积增加，但从1.5～2.5g总峰面积增加不显著，虽然2～3g之间随样品量的增加总峰面积增加，但标准差较大，所以最终选择样品质量为2g。图4样品量对发酵菜粕风味物质总峰面积的影响2.53种菜粕发酵前后风味物质组分的比较由表2、3、4可知，发酵前3种菜粕中风味物质的含量分别为649.98µg/g，682.66µg/g，566.17µg/g，发酵后3种菜粕中风味物质的含量分别为2420.02µg/g，2556.54µg/g和3219.04µg/g，可见发酵后3种菜粕的风味物质含量都显著的高于发酵前，即发酵可提高菜粕的风味；并且高和中硫苷含量的菜粕在发酵前风味组分含量略高于低硫苷菜粕，但发酵菜粕的风味随硫苷含量的增加依次降低，这可能是由于硫苷等抗营养组分含量较高，不利于菌的生长，这可由菌的生长状态得到验证。一般随着发酵时间的增加，菜粕培养基被菌利用后会逐渐变的粘稠，菌株生长的越好，培养基越粘稠。对比3种菜粕培养基发现，在相同的培养条件下，培养基的粘稠程度由新疆菜粕、四川菜粕和中双11菜粕依次增加，即在中双11菜粕培养基上菌株生长的最好。由风味物质含量可看出，发酵前对新疆、四川和中双113种菜粕风味物质贡献率最大的组分都是2-硝基噻吩，分别占总挥发性组分含量的18.21%、22.21%和17.77%；其次都是苯丙腈，分别约占总风味物质组分的13.35%、14.35%和13.05%。发酵后2-硝基噻吩和苯丙腈这两种组分在新疆发酵菜粕风味物质组分的百分含量变化不大，分别为18.30%和12.15%；但在四川和中双11这两种发酵菜粕风味物质组分的百分含量变化较大，在四川中分别降低为5.05%和17.74%，在中双11中分别降低为9.23%和4.78%。菜粕发酵后吡嗪类对新疆、四川和中双11这3种菜粕风味物质组分贡献率分别增加20.00%、25.34%和21.49%，其中四甲基吡嗪增加最多，分别增加13.58%、14.47%和13.11%；发酵后腈类组分的百分含量分别降低1.20%、11.24%和10.14%。发酵后新疆、四川和中双11这3种菜粕中醛类的百分含量都显著降低，醇类、酯类百分含量都显著增加。可见发酵前后菜粕的风味物质组分发生了显著的变化，发酵菜粕中刺激性的腈类的含量显著降低，而吡嗪类、酚类、酸类和醇类物质显著增加。表2菜粕(新疆)发酵前后主要风味物质含量比较(µg/g)发酵前发酵后发酵前发酵后风味物质含量含量含量含量三甲基吡嗪0.000.002-甲氧基-4乙烯基苯酚12.61120.812,6-二乙基吡嗪0.00110.46苯酚0.0019.462,3-二甲基-5-乙基吡嗪0.000.00异硫氰酸烯丙酯6.2119.46四甲基吡嗪20.43465.052-甲基-戊酸甲酯0.0017.262,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪0.0058.99十二烷6.770.00苯丙腈88.70300.93十三烷6.630.00正癸醛5.950.00十四烷11.6425.42苯甲醛5.890.00十甲基环戊硅氧烷9.780.00吡咯-2-甲醛0.0020.08十二甲基环六硅氧烷33.0493.51壬醛19.9427.611,1-二甲基-肼4.8115.382-十三酮0.0017.89l-甲氧基-4-(1-丙烯基)苯2.2638.913-甲基-丁酸15.7294.45丁基羟基甲苯8.4664.64己酸6.930.00α-荜澄茄苦素83.24107.01壬酸3.190.002-硝基噻吩121.05416.41n-十六酸2.660.00氯甲基甲硫醚43.99180.751-己烯-3-醇7.4575.632,3,5,6-四氟茴香醚6.9616.951,2-环硫-3-己醇3.600.00N-乙基-N-苄基-异丙基苯甲酰胺84.050.002,3-丁二醇0.0022.59N-羟甲基乙酰胺6.430.002-甲氧基-苯酚21.5990.37表3菜粕(四川)发酵前后主要风味物质含量比较(µg/g)发酵前发酵后发酵前发酵后风味物质含量含量风味物质含量含量三甲基吡嗪1.94106.66甲基异氰酸酯0.000.002,3-二甲基吡嗪0.0015.242-甲基戊酸甲酯0.0058.932,6-二乙基吡嗪,0.0034.131-异硫代氰酸丁酯0.0010.14四甲基吡嗪21.13444.46十六酸甲酯0.009.182,3,5-三甲基-6-丁基吡嗪0.0023.044-异硫氰酸基-1-丁烯0.0058.442,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪0.00103.754-甲基-1-己烯45.5099.012,4-戊二烯腈2.655.11十甲基环戊硅氧烷10.210.00苯丙腈96.10128.90十二甲基环六硅氧烷36.2859.294-甲硫基-丁腈8.110.00十六烷2.679.17苄腈2.440.00十三烷3.080.00壬醛31.490.00十四烷13.0621.56癸醛7.390.003-甲基-十五烷5.780.00苯甲醛6.750.00l-甲氧基-4-(1-丙烯基)苯4.9216.143-甲基-丁酸13.97168.15丁基羟基甲苯9.1751.83己酸6.040.00α-荜澄茄苦素79.52168.07壬酸5.190.002-硝基噻吩151.46456.592-氨基-4-甲基苯甲酸0.000.00氯甲基甲硫醚56.490.002,3-丁二醇0.00120.985-(2-丙烯基)-1,3-苯并二茂7.020.001-己烯-3-醇7.7251.57苯并噻唑5.860.002-甲氧基-4乙烯基苯酚13.5575.48羟乙基-环己烷0.0022.462-甲氧基-苯酚27.1748.38N,N-二甲基硫代甲酰胺0.00180.77苯酚0.009.11表4菜粕(中双11)发酵前后主要风味物质含量比较(µg/g)发酵前发酵后发酵前发酵后风味物质含量含量风味物质含量含量三甲基吡嗪3.78176.17十五酸甲酯0.0049.562,3-二甲基吡嗪0.0051.292-甲基-丙酸0.0039.112,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪5.0997.6712-甲基-十三烷酸甲酯0.0024.73四甲基吡嗪14.96512.242-甲基-丙酸6.0074.15苯丙腈73.72152.98辛酸甲酯0.0020.974-甲硫基-丁腈6.680.004-甲基-1-己烯0.0062.98苄腈3.890.00十甲基环戊硅氧烷12.4481.11壬醛25.660.00十二烷3.350.00癸醛7.610.00十二甲基环六硅氧烷31.450.00苯甲醛4.190.00十四烷11.3527.753-甲氧基苯乙酮0.000.003-甲基-十五烷4.050.002-甲基-丁酸0.00200.17十六烷2.170.003-甲基-戊酸11.170.00l-甲氧基-4-(1-丙烯基)苯4.7921.16壬酸2.210.00丁基羟基甲苯7.6665.59己酸5.950.001,1-二甲基-肼0.0055.291-己烯-3-醇3.8983.27氯甲基甲硫醚39.41281.452,3-丁二醇0.00155.612-硝基噻吩100.50297.242-甲氧基-苯酚20.0176.93氯甲基甲硫醚34.56177.31苯酚0.0029.485-(2-丙烯基)-1，3-苯并二茂2.630.002-甲氧基-4-乙烯基苯酚9.9948.43苯并噻唑4.590.00甲基异氰酸酯12.260.002,3,5,6-四氟茴香醚4.060.002-甲基戊酸甲酯0.0042.07N-羟甲基乙酰胺0.00267.489-十八烯酸甲酯0.009.71N-乙基-N-苄基-异丙基苯甲酰胺86.100.00十六酸甲酯0.0037.14从表5可以看出发酵后新疆、四川和中双11这3种菜粕中的硫苷总含量都显著降低，且各分量硫苷也都显著降低，可见，发酵显著降低了硫苷的含量，显著降低了菜粕的毒性和刺激性物质的含量。表5发酵前后菜粕硫苷组分比较硫苷新疆四川中双11发酵前发酵后发酵前发酵后发酵前发酵后2-羟基-3-丁烯基硫苷葡萄糖苷0.110.259.280.211.950.03反式-2-羟基-3-丁烯基硫苷葡萄糖苷0.000.003.720.030.310.01丙烯基脱硫硫苷葡萄糖苷95.7910.810.000.000.000.004-甲基亚砜丁基硫苷葡萄糖苷0.000.001.250.010.250.022-羟基-4-戊烯基硫苷葡萄糖苷0.000.000.260.030.240.023-丁烯基硫苷葡萄糖苷2.630.316.740.021.240.014-羟基-3-吲哚甲基硫苷葡萄糖苷2.600.063.550.003.660.00总硫苷(µmol/g)101.1211.4324.800.297.640.08结论本试验确定了固相微萃取分析菜粕中的风味物质的最优条件为:50/30µmDVB/CAR/PDMS萃取头，温度70℃，吸附30min，样品量为2g。该法能有效分析发酵菜粕中的吡嗪类、腈类、醇类、醛类、酯类、醚类、酮类等物质。通过3种菜粕发酵前后风味物质和硫苷组分的变化可看出发酵可显著降低菜粕中腈类和硫苷的含量，增加吡嗪类、酚类、酸类和醇类物质的含量，不但降低了菜粕的毒性而且改善了菜粕的风味物质组分。参考文献[1]LomascoloA,Uzan-BoukhrisE,SigoillotJC,etal.Rapeseedandsunflowermeal:areviewonbiotechnologystatusandchallenges[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2012,95(5):1105-1114[2]李培武.甘蓝型油菜叶片与种子硫苷相关性研究[D].武汉:华中农业大学,2007LiPW.GlucosinolateandTheirrelationshipbetweenleavesandseedsinbrassicnaus[D].Wuhan:HuazhongAgriculturalUniversity,2007[3]FAO.(2014).Http://faostat3.Fao.Org/faostat-gateway/go/to/download/q/qc/e(accessedmay22,2014)[4]RodriguesIM,CoelhoJFJ,CarvalhoMGVS.Isolationandvalorisationofvegetableproteinsfromoilseedplants:methods,limitationsandpotential[J].JournalofFoodEngineering,2012,109(3):337-346[5]Szydłowska-CzerniakA,AmarowiczR,SzłykE.Antioxidantcapacityofrapeseedmealandrapeseedoilsenrichedwithmealextract[J].EuropeanJournalofLipidScienceandTechnology,2010,112(7):750-760[6]罗振福.菜粕的固态发酵参数研究及在生长猪上应用效果评估[D].长沙:湖南农业大学,2010LuoZF.Studiesonsolid-statefermentationparametersofrapeseedmealandevaluationofdietscontainingfermentedrapeseedmealongrowingpigs[D].Changsha:HunanAgriculturalUniversity,2010[7]TripathiMK,MishraAS.Glucosinolatesinanimalnutrition:Areview[J].AnimalFeedScienceandTechnology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