白藜芦醇通过线粒体途径减轻大鼠重症急性胰腺炎肺损伤

白藜芦醇通过线粒体途径减轻大鼠重症急性胰腺炎肺损伤白藜芦醇通过线粒体途径减轻大鼠重症急性胰腺炎肺损伤

：沙焕臣，拉吉姆，马清涌，徐复国，马振华

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白藜芦醇通过线粒体途径减轻大鼠重症急性胰腺炎肺损伤

;1.2.1动物分组及SAP模型建立将32只大鼠随机分为假手术（SO）组、SAP组、RES治疗组和地塞米松（dexamethasone,DEX）组，每组动物8只.大鼠禁食12h，禁水4h，25g/L戊巴比妥钠（1.2mg/kg）腹腔注射麻醉.动脉夹夹闭胰胆管近端和远端，40g/L牛磺胆酸钠（1mL/kg）经胰胆管逆行注射建立SAP模型，注射时间保持1min，拔出穿刺针，取出动脉夹.SO组仅于开腹翻动十二指肠后缝合腹壁，胰胆管内不注射任何药物；在建立SAP模型后，经阴茎背静脉RES组马上注射RES10mg/kg；DEX组马上注射DEX0.5mg/kg.大鼠在制模后12h剖杀取材.

1.2.2大鼠腹水计量和死亡率记录在取材前先打开大鼠腹壁，以10mL无菌注射器收集大鼠腹水并计量.大鼠死亡率计算方法为未到12h死亡的大鼠从本组中排解，另选大鼠补齐，以死亡的大鼠数量和总计应用的大鼠数量比值计算大鼠死亡率.

1.2.3动脉血PaO2检测在大鼠剖杀前从腹主动脉取血0.5mL,应用iSTAT全自动血气分析仪检测各组大鼠动脉血气分析.

1.2.4血浆TNFα和IL6ELISA检测应用ELISA检测试剂盒检测大鼠血浆中TNFα和IL6含量，具体步骤严格根据试剂盒说明书进行操作.

1.2.5肺组织和胰腺组织的病理学观看肺组织和胰腺组织40g/L多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观看胰腺组织病理学转变.另取肺脏和胰腺组织1mm×1mm×1mm以25g/L戊二醛4℃固定8h，梯度乙醇脱水，环氧树脂Epon812浸透，LKBV型超薄切片机进行超薄切片（50~70nm），电镜下观看肺和胰腺组织超微结构转变.

1.2.6肺组织总RNA提取及RTPCR用Trizol试剂提取肺组织中的总RNA，测定260nm/280nm的A值，计算RNA浓度.取RNA2μL，用RT试剂盒合成cDNA链.再以逆转录反应液2μL作为模板，PCR试剂盒进行扩增.PCR反应条件为：变性94℃30s，退火55℃45s,延长72℃1min，共30个循环；72℃延长10min终止反应.扩增产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统摄影.检测指标为凋亡调控基因Bax，Bcl2和Caspase3，以βActin作为内参照.Bax引物序列为：上游5′TCCAGGATCGAGCAGA3′，下游5′AAGTAGAAGAGGGCAACC3′(256bp)；Bcl2引物序列为：上游5′CTGGTGGACAACATCGCTCTG3′，下游5′GGTCTGCTGACCTCACTTGTG3′(228bp)；Caspase3引物序列为：上游5′GGAGCTGGACTGTGGCATTGA3′，下游5′CAGTTCTTTCGTGAGCATGGA3′（232bp）内参照βActin序列为：上游5′ATTGTAACCAACTGGGACG3′，下游5′TTGCCGATAGTGATGACCT3′(533bp).

1.2.7WesternBlot检测肺组织蛋白和线粒体内蛋白提取后,BCA法测定蛋白含量，按每泳道加总蛋白50μg进行SDSPAGE凝胶电泳，湿转致硝酸纤维素滤膜，50g/L脱脂奶粉室温封闭2h，加入小鼠抗大鼠Bax，Bcl2，Caspase3和Cytc（1∶1000）一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜4次，每次15min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶6000），ECL增加化学发光系统显色20min，X光片曝光.βactin作为内参照对上样全都性进行评估.采纳GDS8000型凝胶成像分析系统进行半定量分析.

统计学处理：应用SPSS13.0进行数据分析，组内比较采纳单因素方差分析，大鼠死亡率应用χ2检验，数据以x±s表示.P0.05为差异具有统计学意义.

2结果

2.1RES对大鼠腹水量、死亡率的影响SO组，SAP组，R

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ES组和DEX组大鼠死亡率分别为：0.0％（0/8）；50.0％（8/16）；27.3％（3/11）；38.5％（5/13）.RES和DEX组大鼠死亡率较SAP组明显降低(P0.05).

2.2RES对大鼠PaO2水平和腹水量的影响SAP组PaO2水平较SO组显著下降，与SAP组比较，RES组PaO2水平明显提高.SO组大鼠腹腔内无腹水，SAP组腹腔内存在大量暗红色血性腹水，RES和DEX组腹水计量结果低于SAP组(P0.05，表1）.

2.3RES对大鼠血浆TNFα和IL6水平的影响SAP组TNFα和IL6含量较SO组明显上升，在应用RES后，血浆TNFα和IL6水平明显下降(P0.05，表1）.表1RES对大鼠PaO2，TNFα，IL6和腹水计量的影响

2.4肺脏和胰腺组织病理学转变光镜下观看可见，SO组胰腺组织无明显病理学转变；SAP组胰腺组织实质坏死、出血及炎性细胞浸润均较严峻，提示SAP模型建立胜利；而RES和DEX组胰腺组织病理转变均较SAP组明显减轻.组织透射电镜观看可见SAP组肺组织存在典型细胞凋亡、线粒体肿胀、细胞水肿、毛细血管充血、血栓形成等病理转变，而RES组和DEX组肺组织上述变化明显减轻（图1）.

2.5RES对肺组织Bax，Bcl2，Caspase3mRNA表达的影响SO组，SAP组，RES组和DEX组肺组织Bax表达水平分别为：（6.09±0.18）%，（13.6±0.87）%，（9.14±0.34）%，（

11.78±1.08）%；Bcl2mRNA表达分别为：（4.69±0.33）%，（2.58±0.81）%，（5.90±0.50）%，（5.31±0.18）%；Caspase3mRNA表达分别为：（4.77±0.47）%，（12.83±0.30）%，（10.11±0.52）%，（11.10±0.85）%.SO组Bax和Caspase3mRNA的表达相对较低或不表达；SAP组Bcl2mRNA表达水平稍有上升，BaxmRNA表达水平明显上升，RES组和DEX组Bcl2mRNA表达水平较SAP组明显上升（P0.05），Bax和Caspase3mRNA表达水平明显下降（P0.05，图2）.

2.6RES对肺组织Bax，Bcl2，Caspase3，Cytc蛋白表达的影响SO组，SAP组，RES组和DEX组Bax蛋白表达水平分别为：382559±19456，1665122±922.73，9912.98±503.16，16192.36±832.24；Bcl2表达分别为：5335.52±368.26，2979.15±125.13，7712.35±815.92，65.06.99±344.36；Caspase3表达分别为：7743.31±316.83，14516.54±861.18，10023.67±213.68，10067.53±955.57；Cytc表达分别为：9737.48±357.78，3473.79±313.16，7221.56±438.72，5630.61±452.87.SO组Bax，Bcl2，Caspase3均为较低水平表达，线粒体内Cytc蛋白呈高水平表达.SAP组Bax和Caspase3表达明显高于SO组，Bcl2和Cytc蛋白表达明显低于SO组（P0.05）.与SAP组相比，RES和DEX组各时间点Bax和Caspase3蛋白表达明显降低，Bcl2和Cytc蛋白表达明显上升（P0.05，图3）.

3争论

在SAP并发的多器官功能损伤中，肺损伤的发病率约为20％［5］.多数学者认为炎症介质如TNFα，IL6介导了肺损伤过程，是造成肺损伤的主要缘由［6］.但是其损伤机制至今仍不清晰.近年来，细胞凋亡的增加在炎症性疾病所致的器官损害中的作用受到越来越多的重视.在调控细胞凋亡的诸多通路中，线粒体通路因其在细胞凋亡调控中所起到的关键作用而受到广泛讨论.我们在胜利建立大鼠SAP模型以后，随着血浆TNFα，IL6水平上升，线粒体通路中凋亡调控基因和相关蛋白表达消失上调，而同时肺组织病理损害程度也相应加重，

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提示由线粒体通路介导的细胞凋亡参加了SAP时肺功能损害的病理生理过程.

在线粒体通路中，Bcl2家族是一族重要的凋亡调控基因［7］.促凋亡的Bax激活后与Bcl2结合，造成线粒体膜电位下降，进而导致线粒体内Cytc从线粒体内释放到细胞浆，Cytc从线粒体释放到胞质后，和细胞质中的Apaf1结合形成复合物，再将Caspase9募集到这个复合物中并将其裂解，从而激活Caspase3，最终导致细胞凋亡的发生.本讨论在应用RES后，促进细胞凋亡的Bax和Caspase3表达明显减弱而抑制细胞凋亡的Bcl2表达明显增加，线粒体内Cytc含量也明显增加.与此同时，反映肺脏功能的PaO2水