普通微生物第十章微生物与基因工程

普通微生物第十章微生物与基因工程第一页，共八十三页，编辑于2023年，星期日

在基因水平上，根据人们的需要以人工的方法取得特定基因，在体外重组于载体DNA分子上，然后将重组DNA转入受体细胞进行无性繁殖（称为“克隆”）和行使正常功能（称为“表达”），从而制备人类需要的基因、基因产物或创造出新的生物类型的分子生物学技术。

基因工程(geneticengineering)第二页，共八十三页，编辑于2023年，星期日

。

载体（Vector）：能容忍外源DNA片段插入，可在细胞间转移并在宿主细胞内自主复制的DNA分子。第三页，共八十三页，编辑于2023年，星期日

不同来源的DNA片段共价连接、通过重新组合构成了具有两个DNA分子遗传信息的新重组体DNA分子的过程。DNA重组（recombination)：第四页，共八十三页，编辑于2023年，星期日转化(transformation)：

以质粒为载体构建的载体DNA，在一定条件下引入受体细胞的过程。或指DNA分子进入宿主细胞的过程。第五页，共八十三页，编辑于2023年，星期日

基因工程核心是构建重组体DNA的技术，因此，基因工程和重组DNA技术(recombinantDNAtechnology)有时为同义词

基因工程的出现使得生物科学迅猛发展，并带动了生物技术产业的兴起！第六页，共八十三页，编辑于2023年，星期日基因工程的特点可设计性稳定性远缘性风险性第七页，共八十三页，编辑于2023年，星期日一、基因工程发展历史基因工程三大理论基础基因工程三大技术发现§1 基因工程概述第八页，共八十三页，编辑于2023年，星期日20世纪40年代：证明了遗传物质是DNA20世纪50年代：DNA双螺旋结构20世纪60年代：确定了遗传信息的传递方式

基因工程理论基础

第九页，共八十三页，编辑于2023年，星期日

(A)注射有荚膜（S型）的致病性肺炎双球菌，小鼠死亡

(B)注射突变的（R型）非致病性肺炎双球菌，小鼠存活。

(C)注射加热杀死的S型，小鼠存活。

(D)注射活的R型与加热杀死的S型的混合物，小鼠死亡。

图1-1肺炎双球菌转化实验第十页，共八十三页，编辑于2023年，星期日

基因工程学重大的技术发现基因工程酶技术

1970年限制性核酸内切酶的分离和纯化（HindIII）分子克隆

1972年Berg首次实现基因重组

1973年Cohen重组DNA转化DNA测序

1975年Sanger实验室建立酶法DNA测序技术

1977年Gilbert实验室又建立化学法DNA测序技术

1980年诺贝尔化学奖授予Berg、Sanger、Gilbert

DNA的分子克隆+DNA测序

—使重组DNA技术系统得以产生第十一页，共八十三页，编辑于2023年，星期日相关理论的复习基因的概念和特性DNA的结构与性能DNA的复制与表达基因组第十二页，共八十三页，编辑于2023年，星期日

一基因的概念遗传学概念：

基因:

是DNA分子中携带特定遗传信息的最小功能单位，控制遗传性状分子生物学定义：编码功能性蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列，负载特定的遗传信息并在一定条件下调节、表达遗传信息，指令蛋白质合成。

第十三页，共八十三页，编辑于2023年，星期日基因的功能分类结构基因（structuregene)：决定蛋白质/多肽链或酶分子结构的基因调控基因(regulatorygene)：调节控制结构基因表达功能第十四页，共八十三页，编辑于2023年，星期日基因的一般特性半保留自我复制决定生物表型或性状基因突变新的生物性状第十五页，共八十三页，编辑于2023年，星期日DNA的结构.两条脱氧核苷酸链成反向平行排列，.一条呈5‘3’方向.另一条呈3‘5’方向。.以碱基配对形成氢键而形成双螺旋结构.遵循互补配对原则即：

A＝TG≡C基本单位：核苷酸（碱基、五碳糖、磷酸）双螺旋结构(A)腺嘌呤(G)鸟嘌呤(C)胞嘧啶(U)尿嘧啶(T)胸腺嘧啶第十六页，共八十三页，编辑于2023年，星期日第十七页，共八十三页，编辑于2023年，星期日DNA的三种构型：

-超螺旋：共价闭环（CCC）

-开环：单链缺口（OC）

-线型：双链断裂（L）LC

cccoc第十八页，共八十三页，编辑于2023年，星期日DNA的性能吸收光谱高峰为260nm

溴化乙啶（EB）嵌入DNA双链配对碱基之间，紫外线照射，可显示DNA位置在电场中的迁移率与分子量大小、构象有关DNA变性：在物理或化学因素作用下，氢键断裂成单链的过程DNA复性：变性因素去除后在适当条件下恢复成双链的过程。第十九页，共八十三页，编辑于2023年，星期日DNA变性(DNADenature)

指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，但不涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素，均可引起核酸分子变性。解链温度:TmTm=69.3＋0.41(%G+C)第二十页，共八十三页，编辑于2023年，星期日DNA复性

(DNARenature)是DNA变性的一种逆转过程。热变性后的DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为退火(annealing)。最佳复性条件一般认为是比Tm低25℃左右的温度复性时温度下降必须缓慢，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4℃以下)，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态。第二十一页，共八十三页，编辑于2023年，星期日DNA的复制与表达半保留复制（semi-conservativereplication）基因表达（geneexpression）mRNA蛋白

转录翻译第二十二页，共八十三页，编辑于2023年，星期日基因组（genome)概念：细胞或生物体的全套遗传物质常见基因组特点：病毒基因组原核生物基因组真核生物基因组第二十三页，共八十三页，编辑于2023年，星期日1.病毒基因组基因组小，基因数少带有重叠基因大部分为编码蛋白质的结构基因第二十四页，共八十三页，编辑于2023年，星期日HBV基因组第二十五页，共八十三页，编辑于2023年，星期日2原核生物基因与表达特点

——细菌基因表达

1）基因组较小2）基因是连续的3）没有转录后加工过程和翻译后加工过程。4）转录和翻译偶联，可同时进行。第二十六页，共八十三页，编辑于2023年，星期日

2.原核生物基因组细菌染色质质粒（plasmid）：

细菌染色体以外的遗传物质，是环状闭合的双链DNA。可自主复制编码生物学形状基因工程常用载体第二十七页，共八十三页，编辑于2023年，星期日

第二十八页，共八十三页，编辑于2023年，星期日真核生物基因组基因组庞大3×106bp、染色质、染色体.基因不连续性断裂基因、内含子、外显子（大部分基因含有内含子）含有大量重复序列非编码区域多于编码区域非编码区较多多于编码序列(9:1）转录和翻译不偶联第二十九页，共八十三页，编辑于2023年，星期日二、基因工程的基本过程一、目的基因的制备(donorDNA)二、体外DNA重组(DNArecombination)三、重组DNA导入宿主细胞(Transformation)四、重组体的筛选鉴定(identification)五、控制外源基因的表达(geneexpression)第三十页，共八十三页，编辑于2023年，星期日基因工程过程示意图①从细胞中分离出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片断③分离大肠杆菌中的质粒④DNA重组⑤用重组质粒转化大肠杆菌⑥培养大肠杆菌克隆大量基因/使其表达③③第三十一页，共八十三页，编辑于2023年，星期日三、微生物学与基因工程的关系1.提供丰富而独特的基因资源2.工具酶3.克隆载体4.基因克隆的宿主5.基因表达的反应器6.有关基因结构、性质和表达调控的理论主要来自对微生物的研究一切基因工程操作都离不开微生物—操作技术和理论指导第三十二页，共八十三页，编辑于2023年，星期日一、从基因文库或cDNA文库分离目的基因二、酶法或化学方法人工合成基因三、PCR扩增基因四、基因的定位诱变§2 基因的分离、合成和定位诱变第三十三页，共八十三页，编辑于2023年，星期日基因文库基因组DNA片段的全部克隆

一、从基因文库或cDNA文库分离目的基因建立基因文库步骤：1、提取基因组DNA2、DNA片段化3、选择合适载体4、DNA与载体连接5、重组体转化或者转染第三十四页，共八十三页，编辑于2023年，星期日第三十五页，共八十三页，编辑于2023年，星期日cDNA文库：生物体全部mRNA的cDNA的克隆总体mRNA的提取利用逆转录酶以寡聚dT或随机寡聚核苷酸为引物合成cDNA的第一条链利用DNA聚合酶Ⅰ，以cDNA的第一条链为模板，用适当引物合成cDNA的第二条链，常用RNA酶H在杂交分子的mRNA链上造成缺口和切口，产生一系列引物，或是除去杂交分子的mRNA后，加入随机引物合成第二条链其它同基因文库的构建第三十六页，共八十三页，编辑于2023年，星期日第三十七页，共八十三页，编辑于2023年，星期日适于遗传背景清楚的细菌染色体

酶切电泳分离DNA化学方法人工合成基因应用：1、合成基因2、合成核酸探针

探针(probe)：用同位素或其它非放射物质标记的一段特定的DNA或RNA片段3、合成DNA引物

二、酶法或化学方法人工合成基因第三十八页，共八十三页，编辑于2023年，星期日聚合酶链式反应

PolymeraseChainReaction,PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法高温变性92～96℃低温复性（退火）40～60℃中温延伸70～72℃三、PCR扩增基因第三十九页，共八十三页，编辑于2023年，星期日PCR基本原理第四十页，共八十三页，编辑于2023年，星期日第四十一页，共八十三页，编辑于2023年，星期日所用DNA聚合酶：Klenow聚合酶1988年Saiki等从水生栖热菌(Thermusaquaticus)分离到TaqDNA聚合酶火球菌(Pyrococcusfuriosus)分离到PfuDNA聚合酶;从Thermococcuslitoralis分离到VentDNA聚合酶从Thermusthermophilus中分离TthDNA聚合酶校正功能第四十二页，共八十三页，编辑于2023年，星期日PCR注意事项：引物的设计2.退火温度3.实验操作第四十三页，共八十三页，编辑于2023年，星期日PCR应用1、基因扩增和制备DNA探针2、临床医学上传染病的检测等3、法医上判定亲缘关系4、定性、定量检测基因表达水平第四十四页，共八十三页，编辑于2023年，星期日qRT-PCR(quantitativereal-timePCR)第四十五页，共八十三页，编辑于2023年，星期日四、基因的定位诱变

在基因精确限定的位点引入突变1、寡核苷酸指导的定位诱变2、盒式诱变3、PCR定位诱变第四十六页，共八十三页，编辑于2023年，星期日1.寡核苷酸指导的定位诱变第四十七页，共八十三页，编辑于2023年，星期日2.盒式诱变(cassettemutagenesis)

较大片段的诱变第四十八页，共八十三页，编辑于2023年，星期日PCR定位诱变3.PCR诱变1）变异部位位于基因的末端引物5‘端限制位点的引入2）变异部位位于基因的中间

重组PCR(recombinantPCR)—Higuchi,1988年第四十九页，共八十三页，编辑于2023年，星期日§3 微生物与克隆载体

克隆载体(cloningvector)：

以扩增外源DNA为目的的载体

到目前为止，基因工程中使用的载体基本上均来自微生物第五十页，共八十三页，编辑于2023年，星期日克隆载体的基本要求应是一个独立的复制子(replicon)具有多克隆位点具有选择标记安全性第五十一页，共八十三页，编辑于2023年，星期日载体的种类一、质粒克隆载体二、λ噬菌体克隆载体三、柯斯质粒载体(cosmidvector—黏粒载体)四、M13噬菌体载体五、噬菌质粒载体(phagemid/phasmid)第五十二页，共八十三页，编辑于2023年，星期日一、质粒克隆载体1.质粒克隆载体的特性：具有独立的复制起点含有多种限制酶的单一识别位点具有较小的相对分子质量1~200kbp外源DNA<15kbp具有较高拷贝数具有便于选择的标记易于导入细胞具有安全性第五十三页，共八十三页，编辑于2023年，星期日2.质粒pBR322的结构特点1977年Bolivar构建环状双链DNA4,361bp外源DNA5kbp左右松弛型质粒，一个复制起点两个抗性基因Tetr

Ampr多克隆位点（multiplecloningsite;polylinker;24）插入失活(insertionalinactivation):

因外源DNA的插入而导致基因失活的现象第五十四页，共八十三页，编辑于2023年，星期日第五十五页，共八十三页，编辑于2023年，星期日3.其它质粒载体pUCpGEM系列第五十六页，共八十三页，编辑于2023年，星期日二、λ噬菌体克隆载体λ噬菌体克隆载体的优点分子遗传学背景十分清楚容量较大（23kbp）具有较高的感染率λ噬菌体克隆载体的构建删除基因组中非必需区除去多余的限制酶切位点第五十七页，共八十三页，编辑于2023年，星期日λ噬菌体克隆载体的种类插入型载体(insertvector)取代型载体(replacementvector)78%~105%第五十八页，共八十三页，编辑于2023年，星期日三、柯斯质粒载体(cosmidvector—黏粒载体)由λ噬菌体的粘性末端(cos位点)和质粒构建而成黏粒的优点具有噬菌体的高效感染率，以质粒形式存在具有质粒的复制方式具有克隆大片段外源DNA的能力(45kbp)第五十九页，共八十三页，编辑于2023年，星期日四、M13噬菌体载体

E.coli丝状噬菌体环状ssDNA6,407bp感染雄性菌后变成复制型dsDNA,以滚环方式复制出ssDNA特点：

1.间隔区插入β-半乳糖苷酶N端一小段编码序列，编码β-半乳糖苷酶的α肽，可与E.coli

lacZ突变基因产物ΔM15进行α互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶。在含有异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和显色物5-

溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(X-gal)的平板上时出现蓝色噬菌斑

2.在α肽的编码区插入多克隆位点，外源基因插入这一区段，破坏

α互补作用，使β-半乳糖苷酶失活，重组体产生白色噬菌斑第六十页，共八十三页，编辑于2023年，星期日M13噬菌体载体克隆能力较小300~400bp特别适合用于制备单链DNA模板、单链DNA探针、定位诱变模板第六十一页，共八十三页，编辑于2023年，星期日五、噬菌粒载体(phagemid/phasmid)

又称噬粒，由噬菌体M13的基因间隔区和质粒载体共同构建的载体

pUC118将野生型M13的基因间隔区插入质粒载体

pUC18构建而成在宿主细胞内以质粒形式存在，产生双链DNA；当辅助噬菌体M13感染宿主细胞后，以滚环方式复制，产生单链DNA特点：分子小容量大10kbp可制备单链或双链DNA，克隆和表达外源基因第六十二页，共八十三页，编辑于2023年，星期日几类大肠杆菌克隆载体比较载体类型 克隆容量 主要用途质粒载体 <15kbp 克隆和表达外源基因，DNA测序λ噬菌体载体<23kbp 构建基因文库和cDNA文库柯斯质粒载体<45kbp 构建基因文库M13载体 300~400bp 制备单链DNA，定位诱变，噬菌体展示噬菌质粒载体<10kbp 制备单链或双链DNA，克隆和表达外源 基因第六十三页，共八十三页，编辑于2023年，星期日六、真核生物的克隆载体1.酵母质粒载体

利用酵母的2μm质粒和其他染色体组分与pBR322构建而成，为穿梭质粒附加体质粒（episomalplasmid)复制质粒(replicatingplasmid)整合质粒(integratingplasmid)第六十四页，共八十三页，编辑于2023年，星期日附加体质粒（episomalplasmid)具有较高拷贝数第六十五页，共八十三页，编辑于2023年，星期日酵母染色体的自主复制序列复制质粒(replicatingplasmid)中等拷贝数第六十六页，共八十三页，编辑于2023年，星期日整合质粒(integratingplasmid)第六十七页，共八十三页，编辑于2023年，星期日2.真核生物病毒载体哺乳动物病毒载体—SV40、腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒昆虫病毒载体—杆状病毒：高容量（100kbp)、高表达效率(25%)、安全植物病毒载体—花椰菜花叶病毒载体，Ti质粒载体第六十八页，共八十三页，编辑于2023年，星期日七、人工染色体

酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC) Murray1983年构建，Burke等1987年用以构建成YAC克隆库，1000kbp容量细菌人工染色体(BAC)-120-300kb第六十九页，共八十三页，编辑于2023年，星期日§4微生物与基因工程工具酶

基因工程所用到的工具酶大多数是从不同微生物中获得的第七十页，共八十三页，编辑于2023年，星期日一、限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)

限制性酶(restrictionenzyme)：能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近特异切割DNA的一类内切酶1.命名与分类EcoRⅠHpaⅠ,HpaⅡ(Haemophilusparainfluenzae，副流感嗜血杆菌)HphⅠ(Haemophilusparahaemolyticus，副溶血嗜血杆菌)Ⅰ、Ⅱ

、Ⅲ三种类型第七十一页，共八十三页，编辑于2023年，星期日2.限制性核酸内切酶的基本特性

识别序列通常由4~8bp组成，具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构(paliindromicstructure)

切割片段理论大小为4nA.黏性末端(cohesiveend)HindⅢ5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’PstⅠ 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’第七十二页，共八十三页，编辑于2023年，星期日B.平末端HpaⅠ 5’-GTTAAC-3’ 3’-CAATTG-5’同裂酶(isoschizomers)同尾酶(isocaudomers)Mun

ⅠEcoRⅠ5’-CAATTG-3’ 5’-GAATTC-3’3’-GTTAAC-5’ 3’-CTTAAG-5’表10-2

常用限制酶第七十三页，共八十三页，编辑于2023年，星期日二、DNA连接酶(DNAligase)T4DNA连接酶：Mg2+和ATP能催化平端连接大肠杆菌DNA连接酶：Mg2+和NAD+其它酶第七十四页，共八十三页，编辑于2023年，星期日§5外源基因导入宿主细胞一、外源基因与载体的体外连接

1.黏性末端连接法

2.接头或衔接物连接法

3.均聚物加尾法

4.平末端连接法第七十五页，共八十三页，编辑于2023年，星期日二、宿主的基本要求与性质1.具有安全性2.能高效吸收外源DNA3.不具有限制修饰系统4.一般为重组缺陷型(RecA-)菌株5.