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实时荧光定量PCR——TaqMan探针法

2021/5/91

序列选取应在基因的保守区段；避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构；典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。

Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；引物之间的TM相差避免超过2℃；引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；

Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp；引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。TaqMan技术引物设计原则2021/5/92TaqMan探针设计原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针；探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性；探针的DNA折叠和二级结构；尽量避开二级结构；

Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），以确保在退火过程中探针先于引物与目的片段结合，GC含量在40%－70%；探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用；整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；为确

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