基因工程及其应用

一基因工程概述二基因工程工具酶三克隆载体四微生物作为克隆载体的宿主五基因工程的常用技术和方法第5章基因工程及其应用当前第1页\共有145页\编于星期五\7点

基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（重组DNA技术）；下游技术涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养及基因产物的分离纯化过程。当前第2页\共有145页\编于星期五\7点

基因重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。供体、受体和载体是重组DNA技术的三大基本元件。当前第3页\共有145页\编于星期五\7点分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种基因工程的目的：当前第4页\共有145页\编于星期五\7点大规模生产生物活性物质工程细胞基因工程蛋白质工程途径工程发酵工程细胞工程分离工程酶酶工程分离工程天然细胞天然细胞生物活性物质当前第5页\共有145页\编于星期五\7点第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程当前第6页\共有145页\编于星期五\7点

一基因工程育种

是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优良性状经其间遗传物质的交换而转移给另—个细胞的方法。当前第7页\共有145页\编于星期五\7点基因克隆过程：１、获得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因与载体在体外连接；３、重组DNA分子导入宿主细胞；４、筛选、鉴定阳性重组子；５、重组子的扩增与／或表达。当前第8页\共有145页\编于星期五\7点当前第9页\共有145页\编于星期五\7点二基因工程常用的工具酶

基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的。包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等。当前第10页\共有145页\编于星期五\7点限制（restriction)与修饰(modification)体系(R/M)：寄主是由两种酶活性配合完成的:

一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶当前第11页\共有145页\编于星期五\7点

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。当前第12页\共有145页\编于星期五\7点

R/M体系的作用：

⑴保护自身的DNA不受限制；

⑵破坏外源DNA使之迅速降解。当前第13页\共有145页\编于星期五\7点1、核酸限制性内切酶的分类I型限制酶的基本特点:反应必须S-腺苷基蛋氨酸、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋，有特异识别位点但没有特异切割位点，切割是随机的。如EcoB和EcoKII型限制酶的基本特点：反应必须ＡＴＰ和Ｍｇ２＋，具有特异性识别部位并切割。如EcoRI、HinfIIIIII型限制酶的基本特点：可以识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24-26bp处切开DNA，切割位点没有特异性。（一）限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）当前第14页\共有145页\编于星期五\7点2、限制性核酸内切酶的命名原则

第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。例：EcoRI:来自于EscheriacoliRY13的第一个限制酶。当前第15页\共有145页\编于星期五\7点形成粘性末端；形成平末端；

3、限制性内切酶作用后的断裂方式当前第16页\共有145页\编于星期五\7点当前第17页\共有145页\编于星期五\7点当前第18页\共有145页\编于星期五\7点

粘性未端：切开后的两段DNA各留下一个尾，这2个尾的核苷酸顺序完全一样，方向相反。它们之间是互补的，在适当条件下可以再连接一起。当前第19页\共有145页\编于星期五\7点SelICGCGThaICGCGSau3AIGATCCTAGBamHIGGATCCCCTAGG同裂酶(来源不同但识别相同靶序列)同尾酶(来源不同，识别靶序列不同但产生相同粘性末端)当前第20页\共有145页\编于星期五\7点4、限制片断的末端连接作用分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。当前第21页\共有145页\编于星期五\7点当前第22页\共有145页\编于星期五\7点5、影响核酸内切酶活性的因素⑴DNA的纯度

DNase的污染(Mg2+)a.增加核酸内切限制酶的用量

b.扩大酶催化反应的体系（稀释）

c.延长酶催化反应的保温时间加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当的温度。当前第23页\共有145页\编于星期五\7点⑵DNA的甲基化程度⑶酶切消化反应的温度大多数酶的标准反应温度37℃。⑷DNA的分子结构某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍。当前第24页\共有145页\编于星期五\7点

⑸核酸内切限制酶标准的缓冲液ａ.氯化镁、氯化钠或氯化钾：不正确的NaCl或Mg++浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致识别序列的改变。ｂ.Tris-HCl：维持最适的pH值（pH＝7.4）。ｃ.β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）：维持酶的稳定性。ｄ.牛血清蛋白（BSA）：维持酶的稳定性。当前第25页\共有145页\编于星期五\7点６、核酸内切限制酶对DNA的消化作用⑴核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列发生作用。⑵核酸内切限制酶对DNA的局部消化完全的酶切消化：识别序列n个碱基的核酸内切限制酶，对DNA的切割能达到每隔4n切割一次的水平。当前第26页\共有145页\编于星期五\7点

局部酶切消化：不让核酸内切限制酶对大量的DNA消化完全，就可以获得平均分子量大小有所增加的限制片断产物，进行不完全的限制酶消化反应。

a.缩短酶切的消化反应的保温时间

b.降低反应的温度（37--4）结束酶的活性

⑶核酸内切限制酶对生物基因组的消化作用小分子量的片断-----少（电泳-容易分离目的片断）大分子量的片断-----多（基因文库）当前第27页\共有145页\编于星期五\7点（二）其它工具酶当前第28页\共有145页\编于星期五\7点１、末端核苷酸转移酶（terminaltransferase）

能催化5’脱氧核苷三磷酸进行5’－3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3’-OH末端。它不需要模板，可以用含有的3’-OHＤＮＡ片段为引物，在3’-OH端加入核苷酸达几百个。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的单链DNA或双链DNA。当前第29页\共有145页\编于星期五\7点当前第30页\共有145页\编于星期五\7点

用途：ａ.催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’末端。可用于测序的终止，一位不含游离的3’-OH末端。ｂ.催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’-末端：生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生素蛋白结合物的接受位点。ｃ.用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。当前第31页\共有145页\编于星期五\7点２、碱性磷酸酶来自于大肠杆菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛肠（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。当前第32页\共有145页\编于星期五\7点当前第33页\共有145页\编于星期五\7点３、S1核酸酶来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链DNA，用于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理。４、反转录酶（reversetranscriptase）这类酶来自于反转录病毒，它可以RNA为模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。当前第34页\共有145页\编于星期五\7点５、连接酶⑴用ＤＮＡ连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断。⑵用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将平末端的DNA片断连接；或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用ＤＮＡ连接酶连接。⑶先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头，形成粘性末端后，再用ＤＮＡ连接酶连接。当前第35页\共有145页\编于星期五\7点ＤＮＡ连接酶：能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。

只能连接切口（nick），不能连接缺口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。当前第36页\共有145页\编于星期五\7点切口切口缺口缺口当前第37页\共有145页\编于星期五\7点

酶－－AMP（腺苷－磷酸）磷酸酰胺键DNA的腺苷酸复合物3’-OH对P原子作亲核攻击形成磷酸二酯键连接酶的作用机理此反应是由焦磷酸(ppi)的水解作用激发的需要花费两个高能磷酸键当前第38页\共有145页\编于星期五\7点

连接酶的来源(1)DNA连接酶：大肠杆菌染色体编码的(2)T4DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的

DNA连接酶－－NAD+T4DNA连接酶－－ATP当前第39页\共有145页\编于星期五\7点Ｔ４ＤＮＡ连接酶（DNAligase）该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ４噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二酯键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。

DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。当前第40页\共有145页\编于星期五\7点当前第41页\共有145页\编于星期五\7点

影响连接酶作用的因素（1）反应温度：连接缺口的温度：37℃

连接粘性末端的最佳温度：4～15℃

（2）Ｔ４ＤＮＡ连接酶的用量：平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。ATP的用量10μmol~1mmol/L之间（3）提高外源片断与载体的浓度的比值（10～20倍）当前第42页\共有145页\编于星期五\7点

粘性末端DAN片断的连接由于具粘性末端的载体易发生自连。对载体的5’末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。而外源片断的5’-P能与载体的3’-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5’-P的链不能进行连接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。

当前第43页\共有145页\编于星期五\7点当前第44页\共有145页\编于星期五\7点

平末端DNA片断的连接（1）T4DNA连接酶（2）用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法当前第45页\共有145页\编于星期五\7点

同聚物加尾法用5’末端特异的核酸外切酶处理DNA片断在A和B中分别加入dATP和dTTP同聚物尾巴10~40个碱基当前第46页\共有145页\编于星期五\7点

同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法，无法用原来的限制酶作特异性的切割。

当前第47页\共有145页\编于星期五\7点衔接物连接法平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：

CCGGATCCGGGGCCTAGGCC

将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。BamHI或Sau3A/NotI当前第48页\共有145页\编于星期五\7点

衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。双衔接物：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。当前第49页\共有145页\编于星期五\7点衔接物连接法当前第50页\共有145页\编于星期五\7点双衔接物连接法的基本程序cDNA链的合成通过DNA聚合酶合成第二链加入SalI衔接物SI核酸酶作用后的末端单链突出序列，由Klenow补齐，加入第二衔接物EcolI当前第51页\共有145页\编于星期五\7点

在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。当前第52页\共有145页\编于星期五\7点DNA接头（adapter）连接法：

1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能产生稳定的二聚体分子。当前第53页\共有145页\编于星期五\7点当前第54页\共有145页\编于星期五\7点DNA接头连接法当前第55页\共有145页\编于星期五\7点

热稳定的连接从嗜热高温放线菌的菌株中分离出来的。能在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接用的一种核酸酶。(1)寡核苷酸连接测定（oligonucletideligationassay,OLA）用两个寡核苷酸探针，同已知序列的靶DNA杂交，探针在靶DNA分子的位置是相邻的。(2)连接酶链式反应（lingasechainreaction,LCR）；也叫连接扩增反应（lingaseamplicationreaction）用寡核苷酸探针通过DNA连接酶的作用扩增已知序列的靶DNA的方法。需要4种引物。当前第56页\共有145页\编于星期五\7点寡核苷酸连接测定

AGTGACCTTCACTGGA

AGTGACCTAGTTACCTTCACTGGATCACTGGA

AGTGACCTACCTAGTGACCTACCT

待扩增的DNA片断PPBBDD地高辛配基生物素磷酸BBBBDDPP阳性信号无信号酶抗生素蛋白由于碱基错配不能形成磷酸二酯键检测单碱基的取代、插入、及缺失而引起的多态性当前第57页\共有145页\编于星期五\7点LCR：ligasechainreaction，连接酶链式反应。样品DNA、探针(4)94度变性当前第58页\共有145页\编于星期五\7点6、DNA聚合酶(1)大肠杆菌DNA聚合酶(2)大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片断酶(3)T4DNA聚合酶(4)T7DNA聚合酶(5)反转录酶当前第59页\共有145页\编于星期五\7点共同点：

把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。当前第60页\共有145页\编于星期五\7点(1)大肠杆菌DNA聚合酶

DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ）

DNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）

DNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）

PolⅠ和PolⅡ的主要功能参与DNA的合成；

PolⅢ的功能同DNA的复制有关；

PolⅠ同DNA分子克隆的关系最为密切。当前第61页\共有145页\编于星期五\7点大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ：

1957年，美国的生物学家A.Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNA聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因编码的一种单链多肽蛋白质，分子量为1091000dal。

DNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成两个片断，一个具有全部的3’5’的外切酶活性和5’3’的聚合酶活性，另一个具有全部

5’3’的外切酶活性。

当前第62页\共有145页\编于星期五\7点

DNA聚合酶Ｉ发挥作用的条件：a底物：四种脱氧核苷5’-三磷酸（dNTP）；bMg＋＋离子；c带有3’-OH游离基团的引物链；dDNA模板：单链，双链（糖-磷酸主键上有一个或多个断裂）。

当前第63页\共有145页\编于星期五\7点当前第64页\共有145页\编于星期五\7点

DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性（a）5’3’的外切酶活性，所切割的DNA链必须是位于双螺旋的区段上；（b）切割部位可以是末端磷酸二酯键，也可以是在距5’末端数个核苷酸远的一个键上发生；（c）DNA的合成可以增强5’3’的核酸外切酶活性；（d）5’3’核酸外切酶的活性位点同聚合作用的活性位点以及3’5’的水解作用位点是分开的。当前第65页\共有145页\编于星期五\7点

DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性

能催化DNA链发生水解作用，从DNA链3’-OH末端开始向5’的方向水解DNA，并释放出单核苷酸分子。

对酶活的影响：

反应物中缺乏dNTPs时，大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性，将会发挥作用。但对于底物是双链的DNA，在具有dNTPs时，这种降解活性将会被5’3’的聚合酶活性所抑制。

当前第66页\共有145页\编于星期五\7点

当前第67页\共有145页\编于星期五\7点

DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：

通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。

DNA缺口转移（nicktranslation）在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶Ｉ的5’3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5’一侧移去一个5’核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的3’一侧补上一个新的核苷酸，但polＩ不能在3’-OH和5’-P之间形成一个键，随着5’一侧的核苷酸不断移去，3’一侧的核苷酸又按序列增补，缺口便沿着DNA分子合成的方向移动。

当前第68页\共有145页\编于星期五\7点

DNA杂交探针的制备

典型的反应体系是。在25μl总体积中含有1μg纯化的特定DNA片断，并加入适量的DnaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未标记的dNTPs。

DnaseＩ：造成DNA分子的断裂或缺口；

PolＩ

：进行缺口转移，使反应混合物中的32p标记的核苷酸取代原有的未标记的核苷酸，最终从头到尾都被标记。当前第69页\共有145页\编于星期五\7点

dNTP对PolＩ酶活性的影响

在低浓度dNTPs的条件下，PolＩ具有良好的活性，提高dNTPs浓度时，PolＩ则能够更有效的合成DNA。低浓度的32p-dNTPs（2μmol/L）和高浓度的dNTPs（20μmol/L）一般希望有30%左右的32p-dNTPs参入DNA链（DnaseＩ数量）。

当前第70页\共有145页\编于星期五\7点(2)Klenow片断

Klenow片断：是由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的分子量为761000dal的大片断分子。仍具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性，失去了全酶的5’3’外切酶活性。

当前第71页\共有145页\编于星期五\7点Klenow片断的主要用途：a、修补经限制酶消化的DNA所形成的3’隐蔽末端；b、标记DNA片断的末端；c、cDNA克隆的第二链cDNA的合成；d、DNA序列的测定。当前第72页\共有145页\编于星期五\7点DNA片断末端标记：具有3’隐蔽末端的带标记得的DNA片断

5’GATCT…3’3’A…5’在反应物中加入Klenow聚合酶α-32p-dGTP,一道温育后生成：

5’GATCT…3’3’32pGA…5’或是同时加入α-32p-dATP＋dGTP5’GATCT…3’3’32pAGA…5’当前第73页\共有145页\编于星期五\7点

DNA片断末端标记可以作为用凝胶电泳法测定分子大小的标记样品。因为被标记的DNA片断是同它们的摩尔浓度成比例，而与他们的分子大小无关。所以在限制酶消化过程产生的大小DNA片断都得到了同等程度的标记。不能够有效的标记带有5’突出末端的DNA分子。当前第74页\共有145页\编于星期五\7点(3)T4DNA聚合酶a从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶。具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性。b在没有脱氧核苷三磷酸存在的情况下，3’外切酶活性便是T4DNA聚合酶的独特功能。作用于双链DNA片断，并按3’5’的方向从3’-OH末端开始降解DNA。如果反应物中存在一种dNTP时，它的水解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止。c在反应过程中，通过T4DNA聚合作用，反应物中的α-32p-dNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA片断上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。

当前第75页\共有145页\编于星期五\7点

合成取代法优于缺口转移法：a不会出现发夹结构而缺口转移制备的探针会出现这种结构；b应用适宜的核酸内切限制酶切割，便可很容易的变成特定序列的探针。当前第76页\共有145页\编于星期五\7点具EcoR1位点的DNA分子对DNA分子3‘端有控制的降解合成作用产生选择性标记T4DNA聚合酶的取代合成法标记DNA断末端及制备链的特异探针当前第77页\共有145页\编于星期五\7点(4)反转录酶：具有反转录酶活性和RNaseH活性。主要作用是以mRNA为模板合成cDNA；用来对5’突出末端的DNA片断作末端标记。当前第78页\共有145页\编于星期五\7点当前第79页\共有145页\编于星期五\7点当前第80页\共有145页\编于星期五\7点

合成cDNA的主要步骤：a应用poly(A)mRNA为模板，以12~18个碱基长的oligo(dT)片断作为引物，加入反转录酶，合成出cDNA第一链;b用碱水解法除去mRNA模板，单链cDNA能自我折叠形成一种发夹结构，作第二链的引物，用反转录酶或Klenow聚合酶催化第二链cDNA的合成；c用SＩ核酸内切酶消化除去单链区的发夹结构。d通过同聚物或合成的衔接物，使DNA分子克隆到适当的载体分子上。当前第81页\共有145页\编于星期五\7点(5)T7DNA聚合酶：

1978年，S.Tabor从感染了T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种核酸酶。具有5’3’的聚合酶活性和很高的单链及双链的3’5’核酸外切酶活性。当前第82页\共有145页\编于星期五\7点T7DNA聚合酶的用途：a用于对大分子量模板的延伸合成；（不受DNA二级结构的影响，聚合能力较强可延伸合成数千个核苷酸）b通过延伸或取代合成法标记DNA3’末端c将双链DNA的5’或3’突出末端转变成平末端的结构。当前第83页\共有145页\编于星期五\7点

修饰的T7DNA聚合酶对天然的T7DNA聚合酶进行修饰，使之完全失去3’5’的外切酶活性。聚合作用的速率增加了3倍。当前第84页\共有145页\编于星期五\7点三克隆载体载体(vector)是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA；一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。当前第85页\共有145页\编于星期五\7点载体应具备以下条件：１、能在适当的宿主细胞中复制；２、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA插入；３、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；４、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离；５、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。当前第86页\共有145页\编于星期五\7点

根据基因组的大小选择合适的载体

载体

plasmidphageλcosmidBACYAC

插入片断

(kb)523453501000当前第87页\共有145页\编于星期五\7点pBR322plasmid当前第88页\共有145页\编于星期五\7点左臂替换型载体右臂克隆位点phageλ应用适当限制性内切酶消化载体，除去可取代的DNA区段；同外源DNA片段连接；对重组体的λDNA分子包装增殖，以得到有感染性的λ重组噬菌体。当前第89页\共有145页\编于星期五\7点cosmid由λDNA片段（cos位点）和质粒DNA共同组成具有λ噬菌体特性：克隆合适大小外源DNA后体外包装可以导入大肠杆菌具有质粒载体特性：能像质粒样复制，具有选择性标记基因高容量克隆能力：45kb与同源序列的质粒进行重组的能力：重组形成共合体当前第90页\共有145页\编于星期五\7点四常用的基因工程宿主1）大肠杆菌2）枯草芽孢杆菌3）酿酒酵母4）动物细胞特点：生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长，遗传学及分子生物学背景十分清楚当前第91页\共有145页\编于星期五\7点宿主细胞必须符合以下条件１、对载体的复制和扩增没有严格的限制；２、不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；３、在重组DNA增殖过程中，不会对它进行修饰；４、重组缺陷型，不会产生体内重组；５、容易导入重组DNA分子；６、符合重组DNA操作的安全标准。当前第92页\共有145页\编于星期五\7点如何获得目的基因？cDNA基因克隆基因组DNA文库限制性内切酶消化机械随机切割PCR方法获得目的基因五基因工程的常用技术和方法当前第93页\共有145页\编于星期五\7点（一）cDNA基因克隆

cDNA文库是指得到足够多的分别克隆的cDNA片段，汇集这些克隆应包含某种细胞中各种mRNA的相应顺序，每种顺序至少有一份拷贝，这种克隆片段的汇集体称为某种细胞的cDNA文库。当前第94页\共有145页\编于星期五\7点1、没有原核生物的cDNA文库原核生物的

mRNA

非常不稳定；原核生物的基因组文库比较容易构建，能包含所有基因的序列。２、cDNA

文库对于真核生物的基因分析

cDNA文库是只含有编码蛋白的基因文库

cDNAs

没有内含子基因可以在E.coli

中直接表达

得到mRNA

反转录获得cDNA当前第95页\共有145页\编于星期五\7点３、mRNA

分离原理当前第96页\共有145页\编于星期五\7点１）

传统的分离方法是用oligo(dT)-纤维素柱分离总RNA２）把oligo(dT)-磁珠同总RNA混合，在强磁场下分离mRNA３）用蔗糖梯度离心mRNA核糖体复合体（溶解细胞）来分离mRNA４、三种分离mRNA的方法当前第97页\共有145页\编于星期五\7点当前第98页\共有145页\编于星期五\7点（二）基因组DNA文库纯化基因组DNA

基因组DNA的片断化:物理切割和限制性内切酶

eukaryotes:从细胞核中去除蛋白,脂类和其他杂质.prokaryotes:直接提取当前第99页\共有145页\编于星期五\7点HaeIII：5’-…GG/CC…

3’,Sau3A:5’-/GATC-3’,AluI:5’-…AG/CT…

3’,

BamH1:5’-G/GATCC-3’（三）限制性内切酶消化1、将片断的末端(粘性或平头)和酶消化的载体连接2、酶切位点是否被修饰3、内切酶消化的时间和用量取决于要插入片断的大小范围当前第100页\共有145页\编于星期五\7点两个特点:第一是假如所需的基因含有所用限制酶的识别位点，那么这一基因将被克隆在两个或数个片段中，给研究带来一定的困难。第二一般常用的限制酶大多识别6个bp序列，切割DNA所产生的片段的平均大小相对比较小，因此整个基因文库要含有非常大量的重组体，这样应用分子杂交法进行筛选就十分费事费时。虽然可以用限制酶进行部分消化，产生约20kb的片段，但这种方法必须掌握好酶解的条件。

当前第101页\共有145页\编于星期五\7点（四）机械随机切割可以制备大片段的DNA（用噬菌体λ作载体约20kb，以cosmid作载体约45kb），从而克服上述的两处缺点。不足之处：所制备的片段的末端顺序是随机的，还必须经过末端修复，人工制造接头等手续才能与载体DNA进行连接。

当前第102页\共有145页\编于星期五\7点

有一些序列不能被克隆

Example:1)序列缺乏酶切位点;2)目的基因包容在一个其大小范围超出载体承载能力的DNA片断上

Toolongforthevectorused当前第103页\共有145页\编于星期五\7点（五）PCR方法获得目的基因聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）特点：在体外模拟细胞内进行的DNA复制过程当前第104页\共有145页\编于星期五\7点根据需扩增片段的两端设计引物。使DNA解链（高温），引物结合于基因的两端（低温），在合适温度下开始合成（链延长）反应。特点：需要很少的DNA模板，且能直接从基因组中得到目的基因。当前第105页\共有145页\编于星期五\7点PCR原理PCR仪当前第106页\共有145页\编于星期五\7点当前第107页\共有145页\编于星期五\7点重组质粒的构建和克隆当前第108页\共有145页\编于星期五\7点

DNA分子的体外连接

DNA片段的体外连接是重组DNA技术的关键。DNA连接是由DNA连接酶催化完成的。当前第109页\共有145页\编于星期五\7点DNA连接酶DNA连接酶催化两条双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的的DNA连接酶是来自T4噬菌体的DNA连接酶。T4DNA连接酶在分子克隆中主要用于：１、连接具有同源互补粘性末端的DNA片段；２、连接双链DNA分子间的平端；３、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。当前第110页\共有145页\编于星期五\7点重组DNA导入宿主菌

体外连接的重组DNA分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据所采用的载体的性质，将重组DNA分子导入受体可有不同的方法。当前第111页\共有145页\编于星期五\7点原核生物的转化与转染E.coli的钙转化E.coli的电穿孔转化转染转导当前第112页\共有145页\编于星期五\7点真核生物的转染1.磷酸钙转染技术2.电穿孔法3.基因枪转染法4.激光微束穿孔法5.显微注射法6.脂质体介导法7.多聚物介导法当前第113页\共有145页\编于星期五\7点（一）遗传转化

转化是指受体细胞直接摄取供体细胞游离的DNA片段，将其同源部分进行碱基配对，组合到自己的基因中，从而获得供体细胞的某些遗传性状。当前第114页\共有145页\编于星期五\7点（二）自然转化一般可人为地分为下列三个阶段(1)感受态的出现

(2)DNA的结合与进入

(3)DNA的整合当前第115页\共有145页\编于星期五\7点(三)操作步骤质粒DNA转化感受态大肠杆菌1．从琼脂平板上挑取新鲜菌落接入10ml肉汤培养基中，37℃培养过夜。2．取0.5ml培养物接入50ml肉汤中，无菌添加0.4ml2.5mol／LMgCl2，于37℃振荡培养。3．将o.1mol／LCaCl2溶液、试管及吸管在冰浴中冷却。当前第116页\共有145页\编于星期五\7点4．当培养物OD600在o.5～o.8左右时，开始收获细胞(大约需2～2.5h)．5．将培养物置冰浴中冷却10min。6．取10ml培养物置2个冷离心管中弃去上清液。7．加入1ml0.1mol／LCaCl2，再加0.9mlCaCl2，置冰浴中放置20min。8．3000r／min离心10min，弃去上清液。当前第117页\共有145页\编于星期五\7点9．加入1ml0.1mol／LCaCl2，重新悬浮细胞，置冰浴中保存。10．加入1～20μl待转化质粒

DNA溶液。11．在冰上放置20min，在37℃处理2min。再插入冰中，加入0.9m1肉汤37℃静置培养90min。12．以不同的量涂布选择培养基平板。13．于37℃培养过夜。鉴定转化菌落。当前第118页\共有145页\编于星期五\7点（四）常用的遗传转化系统1、自然系统2、人工诱导（完整细胞）（1）二价阳离子系统：Ca2+，Ca2++Mg2+，Mg2+，Ca2++辅助噬菌体，Tris+Ca2+（2）单价阳离子系统：PEG+Li+/Cs+/Rb+（3）冻融系统（4）Triton处理：人工诱导（PEG/原生质体）当前第119页\共有145页\编于星期五\7点（五）转染和感染

利用噬菌体DNA作为载体时可经两种方式导入受体菌。一种是感染，即在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。另一种方式是转染，即在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。当前第120页\共有145页\编于星期五\7点重组克隆的筛选与鉴定

基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。当前第121页\共有145页\编于星期五\7点（一）抗药性标志的筛选

如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr或tetr

，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，该标志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，还可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落。当前第122页\共有145页\编于星期五\7点（二）β－半乳糖苷酶系统筛选很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码β－半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α－肽，它表达β－半乳糖苷酶的C-端肽链。当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal变为兰色化合物，这就是所谓的α－互补。而重组子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互补，在含X-gal的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。当前第123页\共有145页\编于星期五\7点（三）菌落快速裂解鉴定法从平板上直接挑选菌落裂解后，直接电泳检测载体质粒大小，判断有无插入片段存在，该法适于插入片段较大的重组子初筛。（四）内切酶图谱鉴定经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶切割，释放出插入片断；对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插入的方向。当前第124页\共有145页\编于星期五\7点重组DNA的鉴定

遗传学方法当前第125页\共有145页\编于星期五\7点

应用核酸探针分离克隆的目的基因1.获得探针2.转膜3.杂交当前第126页\共有145页\编于星期五\7点探针的来源某种生物实验体系中分离到的基因序列，可作为从其它生物中分离相关基因的核酸探针。2.根据蛋白质家族保守性，合成核酸探针。功能相同或相近的蛋白质，存在着具有共同氨基酸序列的区段（保守区），往往由彼此相邻的6~7个氨基酸组成。当前第127页\共有145页\编于星期五\7点

３.探针的长度；要使探针与目的基因序列严格互补，最少的探针长度15~16个核苷酸，实验中为保证足够的特异性，通常使用17~20个核苷酸。４.简并性；根据蛋白质氨基酸组分合成的寡核苷酸探针，通常是混合物的形式。在这种探针库中，只有一种是与目的基因完全互补的。当前第128页\共有145页