肝衰竭机制及治疗进展

肝衰竭机制及治疗进展

中山大学附属第三医院感染科高志良教授中山大学附属第三医院当前第1页\共有116页\编于星期五\12点

肝衰竭（liverfailure,LF）中山大学附属第三医院当前第2页\共有116页\编于星期五\12点

肝衰竭一、肝细胞死亡的发生机制肝细胞死亡超过了肝脏的再生能力，即会发生肝衰竭经典的肝细胞死亡模式分为两类，即坏死与凋亡坏死往往继发于各种肝损伤所导致的ATP耗竭，细胞肿胀溶解，导致胞内容物的释放和继发性炎症反应的发生凋亡为ATP依赖的程序性细胞死亡方式，其细胞因皱缩而独立出来，染色质固缩，DNA断裂成规律性片段，并被胞膜包绕形成凋亡小体，后者可由邻近巨噬细胞吞噬，以最大限度的减轻细胞内容物的渗漏和炎症反应肝脏病理中我们可以观察到肝细胞的坏死与凋亡是并存的。研究证据提出新的观点，坏死与凋亡是源于相同启动因素和信号转导途径的不同的细胞死亡方式，这一过程被命名为坏死性凋亡。中山大学附属第三医院当前第3页\共有116页\编于星期五\12点

肝衰竭细胞肿胀是坏死早期最为显著的特征在ATP耗竭后，肝细胞骨架蛋白的形态结构发生改变，促成浆膜大泡的形成。随即出现以线粒体去极化、溶酶体破裂、双向阴离子荧光团泄漏及浆膜大泡肿胀加剧为特征的亚稳态。该状态持续几分钟后浆膜大泡破裂，导致浆膜渗透压屏障不可逆的损伤，各种跨膜电子、离子梯度的断裂，以及溶质酶和代谢中间产物的渗漏，最终细胞失去活性中山大学附属第三医院当前第4页\共有116页\编于星期五\12点病因中山大学附属第三医院当前第5页\共有116页\编于星期五\12点传统治疗一、内科综合治疗(抗病毒治疗)二、免疫调节治疗三、并发症的治疗中山大学附属第三医院当前第6页\共有116页\编于星期五\12点治疗现状一、人工肝二、肝移植三、细胞治疗中山大学附属第三医院当前第7页\共有116页\编于星期五\12点我科治疗现状中山大学附属第三医院1998~2004年我科肝衰竭治疗效果情况

当前第8页\共有116页\编于星期五\12点我科治疗现状中山大学附属第三医院1998~2004我科治疗肝衰竭的有效率（治愈率+好转率）

当前第9页\共有116页\编于星期五\12点Newstrategy

乙肝肝衰竭的时相分层治疗新策略2008年中山大学附属第三医院当前第10页\共有116页\编于星期五\12点策略简介以肝脏为主体对象的肝衰竭时相分层治疗新策略以肝外脏器为主题对象的并发症干预新策略中山大学附属第三医院当前第11页\共有116页\编于星期五\12点层次观点病因治疗层面：全程监控——抗病毒

病理生理层面：以控制过激的免疫攻击为基础，以肝细胞修复治疗（干细胞移植）为终极目标，并辅以肝外脏器的稳定治疗。

中山大学附属第三医院当前第12页\共有116页\编于星期五\12点研究方案肝脏免疫指标检测与干预治疗病情档案、随访门诊、“三库”

人工肝干细胞临床研究肠道微生态临床研究内毒素研究肝外脏器对症支持抗病毒肠道微生态、内毒素机制研究动物模型（实验基础）中山大学附属第三医院当前第13页\共有116页\编于星期五\12点创新点

本项目在国内外:首次宏观、全面的对乙肝肝衰竭的病程进行监控和处理。从观念上更新乙肝治疗的策略与方法。

中山大学附属第三医院当前第14页\共有116页\编于星期五\12点上升前期上升期

平台期终末期（肝移植/死亡）恢复期TBIL时间抗病毒治疗干细胞治疗免疫治疗中山大学附属第三医院以肝脏为主体对象的肝衰竭时相新观点当前第15页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院慢性肝衰竭上升期

三重打击学说当前第16页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院第一重打击–免疫损伤以CTL为中心的细胞免疫：

免疫效应细胞，CD8+CTL；靶抗原，HBcAg、HBeAg、pre-S1、S2I类MHC分子。肝细胞凋亡途径：

穿孔素颗粒酶系统；Fas系统；TNF系统；TRAIL。当前第17页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院第一重打击–免疫损伤尽管TRAIL介导的细胞凋亡途径已被阐明，但其是否与Fas-L、TNF-α途径一样在急性肝衰竭的疾病进程中发挥重要作用尚不明确体内外研究表明正常肝细胞对于TRAIL介导的凋亡反应耐受，而慢性病毒感染、脂肪变性及毒性物质的刺激却可上调肝细胞TRAIL的表达，进而通过TRAIL配体/受体系统特异性清除病毒感染的肝细胞或肝癌细胞TRAIL配体/受体途径对于肝细胞选择性诱导凋亡的作用为病毒性肝炎与肝胆管系统恶性肿瘤的治疗提供了潜在的治疗靶点。当前第18页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院第一重打击–免疫损伤持续的HBV复制严重损伤了病毒特异性T细胞功能，包括增殖和分泌细胞因子IL-2、IFN-r和INF-a的能力。这种T细胞的功能损伤称之为功能耗竭(exhausition)，可能与抗原提呈细胞（主要是DC）功能低下、调节性T细胞（RegulatoryTcells，Tregs）增多以及抑制性受体的高表达有关。CD28家族的程序性死亡受体1（PD-1）分子可作为这些功能耗竭的T细胞重要标志。ZhangZetal.JHepatol2007，47：751-759XuDPetal.JImmunol,2006,177(13):739-747ChenLetal.NatRevImmunol,2004,4(5):336-347当前第19页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院第一重打击–免疫损伤

缺乏PD-1表达将会失去对T细胞反应过强的控制，从而诱发免疫病理损伤，促进急性肝衰竭的发生。当前第20页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院第一重打击–免疫损伤RadziewiczHetal.Gastroenterology,2008,134(7):2168-2171

当肝脏炎性反应轻微时，肝内T细胞低表达PD-1，同时肝细胞也低表达PD-L1，这样TCR信号可诱导T细胞发生正常的免疫应答。当肝脏炎性反应增强时，肝内增强的PD-1/PD-L1信号途径就会抑制并损伤T细胞反应。当肝脏炎性反应进一步增强时，肝内的PD-1/PD-L1信号途径就会提高反应性T细胞凋亡敏感性，从而抑制免疫应答。当前第21页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院第一重打击–免疫损伤RadziewiczHetal.Gastroenterology,2008,134(7):2168-2171当前第22页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院第一重打击–免疫损伤

PD-1/PD-L1结合可能通过两条途径来抑制肝内T细胞反应：通过磷酸化接头蛋白减弱TCR信号、降低T细胞功能；干扰细胞周期，提高细胞凋亡敏感性。RadziewiczHetal.Gastroenterology,2008,134(7):2168-2171当前第23页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院

第一重打击–免疫损伤肝细胞内病毒的复制诱导产生多种细胞因子，以TNF-α为核心的炎症反应，包括TGF-β1对肝细胞再生的抑制作用，TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8水平的升高。另外，IL-15和NK细胞也可能在重型肝炎发病中起一定的作用。

当前第24页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院第二重打击–缺血缺氧

与其它高需氧的组织器官类似，肝脏对供血不足引起的损伤极为敏感。其中低流量性缺血，即血供被完全阻断时，整个肝脏将处于缺氧状态。而低流量性缺氧，即仍有血供但不足以满足氧需时，肝小叶中央区域而非周边区域将发生缺氧。由于肝脏具有双重血供系统，由低流量性缺氧造成的中央区域肝细胞的坏死是更为常见的现象。当前第25页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院第二重打击–缺血缺氧

缺氧条件下肝脏微循环的紊乱导致肝脏损伤一系列肝脏损伤的启动因素去除后，ALT/LDH指标持续低下预示肝脏缺血存在巨噬细胞的过度激活在急性肝衰竭病人的进展中起关键性的作用，肝脏中活化和增殖的巨噬细胞损伤内皮细胞，扰乱肝脏微循环。KazuhiroKotoh,Hepatology2008,7:6当前第26页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院第二重打击–缺血缺氧

KazuhiroKotoh等回顾性研究了日本33例急性肝脏损伤病人，分为存活组和死亡组病人入院后第三天ALT/LDH指标与MELD评分ROC曲线下面积分别为0.893、0.777存活组在LDH达到高峰之后，ALT/LDH指标迅速增高死亡组LDH延迟降低，ALT/LDH指标低，由肝脏微循环紊乱引起KazuhiroKotoh,Hepatology2008,7:6当前第27页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院第二重打击–缺血缺氧

LorrieA.等研究了细胞信号抑制因子的表达与小鼠肝脏缺血再灌注损伤严重性的关系TNF、IL-1β、IL-6和IFNγ通过JAK-STAT通路对缺血再灌注损伤有重要的作用LorrieA.JournalofHepatology49(2008)198–206.当前第28页\共有116页\编于星期五\12点这项研究第一次揭示了肝脏缺血再灌注损伤进展之间的关系，前炎症介质的诱导及负信号调节机制的活化GPT的清除，仅仅表示肝细胞很少继续坏死，不能预示恢复当前第29页\共有116页\编于星期五\12点细胞因子在不同时间的表达支持动态调控机制的出现SOCS3在肝脏缺血再灌注中参与急性调节，轻微的损伤SOCS3能够控制细胞因子的表达SOCS1的诱导是一种辅助的调控机制当前第30页\共有116页\编于星期五\12点肝脏缺血再灌注后，IL-6是SOCS1、SOCS3的主要诱导物

在外伤和多器官功能衰竭的病人中，IL-6

作为损伤严重性和死亡率的潜在性标记当前第31页\共有116页\编于星期五\12点高IL-6水平与预后差存在相关性，标志着负调节机制不足多器官功能衰竭时，负调节机制在局部或偏远损伤时诱导不充分，阻碍内环境的稳定及抑制炎症的进展当前第32页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院第三重打击–内毒素血症激活枯否细胞细胞因子（

TNF…）炎性介质（PAF…）NO，内皮素，自由基，etc微循环障碍肝损害HanDWetal.WorldJGastroenterol,2002,12,(8);961-966内毒素当前第33页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院第三重打击–内毒素血症肝脏内毒素肠道菌群失调肠道屏障肝脏解毒功能门脉高压当前第34页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院第三重打击–内毒素血症内毒素经典途径：classicalCD14dependentpathway旁路途径：

otherpathway-sCD14

LBP：LPSbindingprotein

GraceLS,etal.Hepatology2000;31:932-936枯否细胞

经典途径旁路途径LBP当前第35页\共有116页\编于星期五\12点UesugiT,etal.RoleofLipopolysaccharide-BindingProteininEarlyAlcohol-InducedLiverInjuryinMice[J].

JImmunol.2002;168(6):2963-9当前第36页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院第三重打击–内毒素血症SCHÄFERC,etal,2002,37,(1),:81–86.当前第37页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院第三重打击–内毒素血症UesugiT,etal.JImmunol.2002;168(6):2963-9LBPKO:LBPknockoutmice.当前第38页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院

LPS刺激肝组织后分泌TNFα,IL-1增多P.Olinga,et.JournalofHepatoloty.2001(35:187-194)第三重打击–内毒素血症当前第39页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院

第三重打击–内毒素血症---P.Olinga,etJournalofHepatoloty.2001(35:187-194)---KnolleP,etal.JHepatol.1995;22(2):226-9

LPS刺激肝组织后分泌IL-6,IL-10增多当前第40页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院

第三重打击–内毒素血症TNF导致肝细胞调亡/坏死QingZangG,etal.WorldJGastroentero,2000;6(5):688-692

6hoursafterGalN/TNF-α,agreatnumberofapoptoticlivercellsarefound

Apoptoticcells(a),apoptoticbodies(b),leukocytes(l)andnecrosis(n).9hours

afterGalN/ET,furtherincreaseofapoptoticlivercellsandpiecesoflivercellnecrosisandbleedingwithleukocytesinfiltrationappear.当前第41页\共有116页\编于星期五\12点QingZangG,etal.EffectofhepatocyteapoptosisinducedbyTNF-αonacuteseverehepatitisinmousemodels[J].WorldJGastroentero,2000;6(5):688-692TNFα抗体可阻断内毒素所引起的肝损害AnalysisofDNAladderfromlivercellextract.MarkerET6h

TNF9hET9hMarker

TNF6hAnti-TNF-α/ET9h——TNF当前第42页\共有116页\编于星期五\12点一种适用于慢加急性肝衰竭预后评估并且优于MELD的评分系统研究目的：试图建立一种适用于慢加急性肝衰竭预后评估并且优于终末期肝病模型(MELD)的评分系统。中山大学附属第三医院当前第43页\共有116页\编于星期五\12点研究背景：全国慢性乙型肝炎病人约2800万约1％病人在病程中发生慢加急性肝衰竭晚期慢加急性肝衰竭死亡率大于80％中山大学附属第三医院当前第44页\共有116页\编于星期五\12点直到目前为止，对乙型肝炎慢加急性肝衰竭包括核苷类似物抗乙型肝炎病毒的内科综合治疗或加上人工肝支持系统治疗，仅对于有足够肝再生能力的病人才能奏效；而无足够肝再生能力的病人只能进行肝移植治疗才能挽救生命。然而，供肝缺乏，术后长期抗排斥和抗乙型肝炎病毒治疗，以及手术费用高昂等因素限制了肝移植治疗的临床应用范围。因此，临床上迫切需要建立一种客观，简便和敏感的评分方法来帮助临床医生评估乙型肝炎慢加急性肝衰竭病人是选择内科综合治疗或/加上人工肝支持系统治疗，还是进行肝移植治疗。中山大学附属第三医院当前第45页\共有116页\编于星期五\12点研究方法：对死亡组196例和存活组203例慢加急性肝衰竭进行MELD评分，同时选择凝血酶原活动度、肌酐、肝性脑病、并发感染、血清总血清胆红素、肝脏大小和腹水等7个肝衰竭相关的临床指标，按照严重性给以1～4分并合计总分，然后比较这两种评分系统的异同。中山大学附属第三医院当前第46页\共有116页\编于星期五\12点当前第47页\共有116页\编于星期五\12点注：感染的评分：1～3分均以白细胞（WBC）计数或中性粒细胞（N）的百分比，先达到者为准计分。4分的标准为：凡有肺部炎症的影像学改变，无论其白细胞和中性粒细胞的值为多少，均计为4分。当前第48页\共有116页\编于星期五\12点表2.本评分系统与MELD评分结果本评分系统t值26.13大于MELD评分t值16.57；ROC曲线下面积分析表明本评分系统比MELD能更准确地预测预后。当前第49页\共有116页\编于星期五\12点80%好转组病人4.02~12.12分80％死亡组病人12.24~21.380396121518212427图1.80％存活组与死亡组病人本评分系统评分的不重叠分布图当前第50页\共有116页\编于星期五\12点80％好转组病人19.23~33.62分80％死亡组病人26.98~53.34分1020153255206303535401845215024505527图2.80％存活组与死亡组病人MELD分值重叠分布图当前第51页\共有116页\编于星期五\12点

用ROC曲线比较MELD和本评分系统的预测能力：两者的分值均能够非常好的预测慢性乙型重型肝炎患者的死亡率MELD和简易评分系统的曲线下面积（c-statistic）分别为0.886(95％C值可信区间为0.852-0.920)和0.960(95％C值可信区间为0.944-0.977)，两者的95％可信区间无重叠，有统计学意义本评分系统对慢性乙型重型肝炎预后的预测能力明显优于MELD系统(图3)。中山大学附属第三医院当前第52页\共有116页\编于星期五\12点图3.MELD与本评分ROC曲线图当前第53页\共有116页\编于星期五\12点结论与MELD评分相比较本研究增加了肝脏缩小，腹水，肝性脑病和感染4个临床指标参与慢加急性肝衰竭的评估，提高本评分系统的敏感性，更适用于慢加急性肝衰竭预后评估。本评分系统是一种敏感性优于MEID评分的客观，简易的评分系统。中山大学附属第三医院当前第54页\共有116页\编于星期五\12点慢性乙型肝炎自然病程中从肝纤维化第1期到4期血清HBVDNA水平逐渐下降，而由相同肝实质体积分摊后没有变化研究背景在慢性乙型肝炎的初期，血清HBVDNA水平处于高水平；相反，在肝纤维化，肝硬化和肝细胞癌时血清HBVDNA的水平处于较低水平。中山大学附属第三医院当前第55页\共有116页\编于星期五\12点研究目的弄清慢性乙型肝炎自然病程中从肝纤维化1期～4期血清HBVDNA水平的变化动态，以及不同肝纤维化分期用相同肝实质体积分摊后的变化动态。研究方法从1期～4期肝纤维化的面积，推算肝纤维化1期～4期的肝实质体积比例见示意图1。中山大学附属第三医院当前第56页\共有116页\编于星期五\12点当前第57页\共有116页\编于星期五\12点研究结果1．慢性乙型肝炎自然病程中从肝纤维化1期～4期的血清HBVDNA水平变化动态，以及用相同肝实质体积分摊后的变化动态见表1：当前第58页\共有116页\编于星期五\12点2．慢性乙型肝炎自然病程中从肝纤维化1期～4期的血清HBVDNA水平变化动态，以及用相同肝实质体积分摊后的变化动态的统计学分析见表2：表2可见：从肝纤维化1期～4期血清HBVDNA逐渐下降有统计学差异，但是，用相同肝实质体积分摊后，4期之间没有存在差异。当前第59页\共有116页\编于星期五\12点结论在慢性乙型肝炎的自然病程中，从肝纤维化1期～4期血清HBVDNA水平逐渐下降与肝实质体积的逐渐缩少造成提供给HBV复制的场所减少有关。中山大学附属第三医院当前第60页\共有116页\编于星期五\12点

恩替卡韦在乙型病毒性肝炎慢加急性肝功能衰竭中的应用研究中山大学附属第三医院当前第61页\共有116页\编于星期五\12点目的观察恩替卡韦治疗对乙型病毒性肝炎慢加急性肝功能衰竭患者生存率的影响。

方法84例治疗组乙型病毒性肝炎慢加急性肝功能衰竭患者在常规内科治疗基础上加用恩替卡韦0.5mg/天治疗，99例对照组患者采用常规内科治疗，观察患者存活情况、肝功能生化学指标、HBVDNA定量、凝血酶原时间，比较两组患者在早期、中期、晚期各期肝功能衰竭生存率的差异。中山大学附属第三医院当前第62页\共有116页\编于星期五\12点结果在早期慢加急性肝功能衰竭患者中，治疗组存活率为63.27%（31/49），高于对照组存活率39.66%(23/58)，P=0.015。在中期慢加急性肝功能衰竭患者中，治疗组存活率为62.96%(17/27)，高于对照组存活率35.14%(13/37)，P＝0.028。在晚期肝功能衰竭患者中治疗组存活率50％（4/8），对照组为25％（1/4），两组比较无显著性差异（P＝0.408）。在血清总胆红素大于342μmol/l的患者中，治疗组存活率为56.00％，高于对照组(26.79％),P＝0.002。在治疗4周时，治疗组HBVDNA载量下降3.95log10copies/mL，高于对照组1.78log10copies/ml（P=0.001）。

中山大学附属第三医院当前第63页\共有116页\编于星期五\12点表1患者人口学及治疗前基线情况(±S)治疗组对照组例数84 99性别（男/女）76/8 88/11 χ2＝0.123P＝0.726年龄（岁） 40.20±10.64 39.54±10.46t=0.427 P=0.670TBili(μmol/l) 386.18±183.48 403.11±180.09t=0.628 P=0.531ALT(U/l) 510.75±697.50 488.75±612.89t=0.238 P=0.812AST(U/l) 419.90±513.35 354.59±386.00t=0.981 P=0.328ALB(g/l) 33.79±5.11 32.51±4.66t=1.764 P=0.079PT(sec) 29.33±10.18 29.09±6.61t=0.192 P=0.848HBeAg阳性率（％）29.76 26.26χ2＝0.277P＝0.599HBVDNA4.976±2.855 3.944±2.662t=2.527 P=0.012(log10copies/ml)中山大学附属第三医院当前第64页\共有116页\编于星期五\12点中山大学附属第三医院恩替卡韦治疗乙型肝炎早期慢加急性肝功能衰竭患者的生存分析当前第65页\共有116页\编于星期五\12点结论在乙型病毒性肝炎慢加急性早期及中期肝功能衰竭患者中，采用恩替卡韦抗病毒治疗能提高生存率，在晚期肝功能衰竭患者中需加大样本量进一步研究。在总胆红素水平高于342μmol/l的患者中，恩替卡韦抗病毒治疗能提高患者生存率。中山大学附属第三医院当前第66页\共有116页\编于星期五\12点

干细胞基础研究及临床应用（肝衰竭治疗）进展中山大学附属第三医院当前第67页\共有116页\编于星期五\12点研究背景中山大学附属第三医院干细胞(stemcell)是目前医学、生物组织工程学等领域研究的热点之一;间充质干细胞(MSCs)

具有多向分化潜能和体外稳定扩增能力,广泛应用于心血管、骨骼、神经、造血及肾脏系统疾病的治疗;Heydarkhan-HS,etal.CellTissuesOrgans,2008;187(4):263.SabrinaC,etal.CellBiolInt,2007;31(8):845.PerinL,etal.PediatrRes,2008Jan24当前第68页\共有116页\编于星期五\12点研究背景中山大学附属第三医院MSCs在肝脏病治疗中的应用

2006年英国科学家首先利用脐带血干细胞培育人类肝脏组织2008年台湾学者通过脾内和静脉注射,采用不同剂量的MSCs治疗肝衰竭的免疫缺陷小鼠显示:MSCs能有效地修复肝损伤PaiM,etal.AmJGastroenterol,2008Jun30.KuoTK.etal.Gastroenterology.2008;134(7):2111-21

当前第69页\共有116页\编于星期五\12点研究背景中山大学附属第三医院BanasAetal.JGastroenterolHepatol.2008Jun25.

PollDvetal.

Hepatology.2008;47(5):1634-43

最近日本Waseda(早稻田)大学研究者在体外和动物体内验证:MSCs具有较强的肝细胞分化特性以及较好的肝损伤修复作用。美国Harvard大学的学者在近期Hepatology上报道:MSCs分泌的细胞因子在大鼠体内能促进肝细胞再生和抑制调亡。当前第70页\共有116页\编于星期五\12点研究背景中山大学附属第三医院自体MSCs避免:免疫排斥反应和伦理学限制,具有良好应用前景.英国伦敦帝国医学院应用自体MSCs对慢性肝病的临床治疗显示:1.该方法是安全的,有效的,未见任何并发症;2.临床症状明显改善,随访12个月～18个月未见肿瘤形成.LevicarN.etal.CellProlif.2008;41Suppl1:115-25当前第71页\共有116页\编于星期五\12点研究背景中山大学附属第三医院印度Hyderabad医院通过肝动脉注入自体MSCs治疗慢性肝衰竭和肝硬化临床研究显示:自体MSCs是安全和有效的A.A.Khanetal.TransplantationProceedings,40,1140–44当前第72页\共有116页\编于星期五\12点基础研究中山大学附属第三医院

1.正常成人MSCs2.肝衰竭患者MSCs3.羊水干细胞4.肝衰竭肝匀浆蛋白对MSCs肝细胞分化影响当前第73页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（1）中山大学附属第三医院正常MSC的分离，纯化，扩增P1P5P15P0YuBaoZheng,ZhiLiangGao.CellBiolInt.2008,32当前第74页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（1）中山大学附属第三医院MSC向肝细胞分化技术成熟BUN(mmol/L)DayDayALB(ng/ug.d)Day12Day18Chanxie,ZhiLiangGao.CellBiolInt.2008,40当前第75页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（1）中山大学附属第三医院

MSC向肝细胞分化诱导Chanxie,ZhiLiangGao.CellBiolInt.2008,40当前第76页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（2）中山大学附属第三医院免疫组化检测HBsAg、HBcAg表达巢式PCR检测HBVDNA及cccDNAMSCs尚未受到HBV感染，并与乙肝病毒复制活跃程度无关

体外以HBVDNA阳性血清培养，MSCs亦不易受到HBV感染乙肝肝衰竭患者MSCs的HBV感染状况研究当前第77页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（2）中山大学附属第三医院

对乙肝患者的BMSCs安全性检测(免疫组化)HepG2HepG2215HepG2HBVP3P5Day18HBsAgHBcAgHBsAgHBcAgChanxie,ZhiLiangGao.CellBiolInt.2008,40当前第78页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（3）中山大学附属第三医院羊水MSCs与骨髓MSCsOct-4基因表达水平的比较YuBaoZheng,ZhiLiangGao.CellBiolInt.2008,32当前第79页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（3）中山大学附属第三医院羊水MSCs与骨髓MSCs向肝细胞诱导分化能力的比较AFMSCsBMMSCs

AFMSCsBMMSCs

YuBaoZheng,ZhiLiangGao.CellBiolInt.2008,32当前第80页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（3）中山大学附属第三医院羊水MSCs与骨髓MSCs细胞遗传学部分研究YuBaoZheng,ZhiLiangGao.CellBiolInt.2008,32当前第81页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（4）中山大学附属第三医院肝衰竭模型大鼠血清、肝匀浆中促进/抑制肝细胞再生蛋白的分析当前第82页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（4）中山大学附属第三医院肝衰竭模型血清和肝匀浆诱导大鼠骨髓MSCs向肝细胞分化ALBALB血清组(×400)肝匀浆组(×400)当前第83页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（4）中山大学附属第三医院肝衰竭模型血清和肝匀浆对大鼠骨髓MSCs体外增殖的影响当前第84页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（4）中山大学附属第三医院凝胶层析法分离纯化正常大鼠与肝衰竭肝匀浆蛋白

123456654321当前第85页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（4）中山大学附属第三医院凝胶层析法分离纯化正常大鼠与肝衰竭血清蛋白

43211234当前第86页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（4）中山大学附属第三医院肝衰竭肝匀浆蛋白成分聚丙酰胺凝胶电泳

当前第87页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（4）中山大学附属第三医院

第1波峰:集中在260KD～50KD；第2波峰蛋白主要集中在220KD～50KD;第3波峰蛋白主要集中在85KD～15KD；第4波峰蛋白主要集中在85KD～12KD;

第5、第6波峰的蛋白在电泳中没有蛋白条带

聚丙酰胺凝胶电泳蛋白条带大致分布当前第88页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（4）中山大学附属第三医院初步分离纯化肝衰竭肝匀浆蛋白对大鼠骨髓MSCs体外增殖的影响当前第89页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（4）中山大学附属第三医院初步分离纯化肝衰竭肝匀浆蛋白对大鼠骨髓MSCs体外肝细胞分化诱导当前第90页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（4）中山大学附属第三医院分离纯化后肝匀浆蛋白对MSCs作用发现:

既有促进MSCs肝细胞的分化(促分化作用);

同时还有对MSCs增殖有抑制作用(毒性作用);

提示肝衰竭患者的血浆和肝脏存在:内促进/抑制肝细胞再生蛋白成分失衡(已整理成文待发表)当前第91页\共有116页\编于星期五\12点基础研究（4）中山大学附属第三医院

(展望)进一步分离血清及肝匀浆中促进MSC向肝细胞分化的蛋白和对增殖抑制的蛋白;寻找具体的目的蛋白质，并进行蛋白测序和鉴定;分离纯化后蛋白应用于人工肝和临床治疗.当前第92页\共有116页\编于星期五\12点临床研究第一代：自体MSCs移植治疗肝衰竭(已施行)第二代：自体MSCs体外培养增殖后移植治疗肝衰竭（研究中）第三代：干细胞诱导分化为肝细胞后移植治疗肝衰竭（研究中）第四代：各种干细胞（羊水干细胞、异体干细胞等）的移植治疗肝衰竭（设计中）中山大学附属第三医院当前第93页\共有116页\编于星期五\12点

第一代：MSCs自体移植治疗肝衰竭

本科室自2005年9月起开始自体MSCs移植治疗肝衰竭的实施与研究，至2006年6月共进行32例，收到明显效果。中山大学附属第三医院当前第94页\共有116页\编于星期五\12点流程病例选择→知情同意→患者准备→采集骨髓→MSCs分离→自体回输移植自体回输移植：1、经介入途径由股动脉到达肝固有动脉2、B超引导下经皮肤到达门静脉右前支中山大学附属第三医院当前第95页\共有116页\编于星期五\12点方法采集骨髓中山大学附属第三医院当前第96页\共有116页\编于星期五\12点方法

分离MSCs（密度梯度离心法）：得到单个核细胞，其中MSCs数量：单个核细胞数量×10-3～10-4个。中山大学附属第三医院当前第97页\共有116页\编于星期五\12点方法介入途径回输中山大学附属第三医院当前第98页\共有116页\编于星期五\12点方法B超途径回输中山大学附属第三医院当前第99页\共有116页\编于星期五\12点对照研究移植组32例，男30例，女2例，43.8±11.3岁。对照组60例，男56例，女4例，44.2±11.3岁。筛选标准：1、重型肝炎患者，诊断依照：《2000年病毒性肝炎防治方案

》。2、无其他肝脏疾病及慢性疾病或脏器功能障碍。3、无严重并发症如严重感染、肝昏迷、肝肾综合征等。4、半年内未进行抗病毒治疗和免疫调节治疗。5、所有患者入院后均同时应用相同内科综合治疗一周：护肝治疗及新鲜血浆、白蛋白等对症支