花药培养和花粉培养

花药培养和花粉培养第一页，共五十三页，编辑于2023年，星期一(1)掌握花药培养和花粉培养的区别(2)了解花药最佳接种时期(3)掌握花药培养的大致过程(4)掌握花粉发育的途径(5)掌握花粉培养的大致过程教学目的与要求第二页，共五十三页，编辑于2023年，星期一花的结构第三页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第四页，共五十三页，编辑于2023年，星期一四分体:醋酸洋红染色四分体:Alexander’s染色单核期双核期成熟花粉粒处于不同发育时期的烟草小孢子第五页，共五十三页，编辑于2023年，星期一花药是花的雄性器官，花药培养属器官培养；花粉是单倍体细胞，花粉培养与单细胞培养相似花药和花粉都可以在培养过程中诱导单倍体细胞系和单倍体植株。单倍体植株经过染色体加倍就成为纯合二倍体植株，这样可缩短育种周期，获得纯系。花培已成为植物育种的一种重要手段。

一、概述第六页，共五十三页，编辑于2023年，星期一植物的花粉是花粉母细胞经减数分裂形成的，其染色体数目只有体细胞的一半，叫做单倍体细胞(haploidcell)。花粉和花药的培养(pollenandantherculture)是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株的技术。用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株，叫做单倍体植物(haplobiont)。一、概述第七页，共五十三页，编辑于2023年，星期一花药培养是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。两者的异同点培养目的相同，均获得小孢子植株。花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高。但技术更复杂。第八页，共五十三页，编辑于2023年，星期一花药或花粉培养的作用：供体植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核发育自然加倍人工加倍纯合植株DH（2n）一年内获得纯系1、作物育种（1）缩短育种周期：常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。第九页，共五十三页，编辑于2023年，星期一大大缩短育种周期通过多次自交或近交获得的几乎是同质结合的品系单倍体植株再通过某种手段使染色体组加倍（如秋水仙素处理）从而使植物恢复正常染色体数第十页，共五十三页，编辑于2023年，星期一例子：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株常规方法：AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开。

（2）提高了目标基因型的选择效率

AB

aB

Ab

abAB AABB AaBB AABb AaBbaB aABB aaBB aABb aaBbAb AabB AabB AAbb

Aabbab aAbB aabB aAbb aabb第十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期一例子：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株单倍体方法：AAbb出现的概率为1/4。

（2）提高了目标基因型的选择效率

单倍体

二倍体

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->AAbb ab---------------------------->

aabb供体亲本AaBb花培第十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期一植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。

（3）诱变育种中的作用

第十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期一2、物种进化研究可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确定染色体组内是否存在同源染色体。

3、遗传分析单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。4、构建连锁图谱双单倍体（DH）群体是永久性群体，能有效地用于遗传图谱的构建5、用于遗传转化能直接表达外源基因，不受显隐性影响第十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期一

花药培养简史1964年：印度学者古哈(Guha)和马斯瓦瑞（Maheswari）将南洋金花花药培养发育成胚1967年：包金(Bourgin)和尼奇(Nitsch)花药培养获得烟草植株1973年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株目前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导成植株第十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期一花药培养的主要目的，是培育花粉粒的单倍体植株，并使单倍体加倍，作为育种材料的来源。利用杂种花药离体培养获得的再生植株，由不同基因型的配子发育而来，具有丰富的变异类型，选择出有利的变异类型，经过经济性状鉴定后，选出优良者直接用于生产或配制杂交组合，获得优良杂交种子。构建永久性分离群体－双单倍体系（Doubledhaploid)，用于基因定位。双单倍体：是指单倍体细胞（花粉或卵细胞）经过人工或自发加倍后得到双单倍体细胞，细胞经诱导分化可发育为单双倍体植株。

花药培养与单倍体育种第十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期一

1、胚状体发育途径 小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。2、愈伤组织发育途径小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。花粉植株形态发生方式第十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期一胚状体发育途径部分花药通过胚状体途径形成小植株烟草花药培养第十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期一通过胚状体途径再生形成小植株烟草花药培养第十九页，共五十三页，编辑于2023年，星期一胚状体发育途径a)球形胚d)鱼雷形胚芸苔属小孢子培养第二十页，共五十三页，编辑于2023年，星期一愈伤组织发育途径部分花药产生愈伤组织接种在平板上的水稻花药水稻花药培养第二十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期一愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株水稻花药培养第二十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期一花药培养1、取材镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。2、消毒70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗3-5次。3、培养固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。第二十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期一花粉培养(一)花粉的分离与纯化1、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法) 将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。2、挤压法在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。3、机械游离（1）磁搅拌法用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；（2）超速旋切法通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。4、小孢子纯化对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子第二十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期一梯度离心前（小孢子形态、活力不一致）30%蔗糖梯度离心后（获得均一的小孢子群体）第二十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期一(二)花粉培养方式1、平板培养花粉置琼脂固化培养基上培养。2、液体培养花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。3、双层培养花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。

4、看护培养利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。5、微室培养利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养6、条件培养基培养利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。第二十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期一看护培养图解第二十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期一确定取材时间选择大致处于所需要时期的花蕾。由于花粉发育时期和植株的某些外部形态特征之间的大致相关性，因此利用这些外部标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花粉发育的准确时期。在水稻中，以单核靠边期的花粉对诱导单倍体植株较为适宜，在外部形态上可根据叶枕距为5～15cm，颖片（禾本科植物小穗基部，由苞片转变而成）淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2这些条件来判断。花药培养技术第二十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期一在培养基中加入活性炭能促进花药培养水稻的柱头-花药第二十九页，共五十三页，编辑于2023年，星期一选取主穗（一级侧枝）的花蕾，因为一级侧枝的花蕾发育良好，数量大，发育同步。操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花粉壁形成二倍体的愈伤组织。注意事项水稻花药培养第三十页，共五十三页，编辑于2023年，星期一水稻花药培养旗叶鞘用70％酒精擦洗一遍剥去旗叶鞘，取出稻穗左手持穗，右手用镊子取出花药，无菌培养皿中70％酒精，洗2遍用接种环接种到培养基上培养5天后，花药变黑褐色，20天花药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组织，先形成芽，后长出根，形成幼苗。第三十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期一光照(12~18h，5,000~10,000lx，28℃)黑暗(12-16h，22℃)周期交替进行。花药培养的条件第三十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期一①花粉发育时期是影响培养效果的重要因素在诱导花粉进行雄性发育(指小孢子沿孢子体途径发育成花粉植株)过程中，不同物种花粉最适的发育时期不同，对多数植物来说，单核中期或晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。如南洋金花、烟草和芍药中的最适时期是第一次有丝分裂时期或稍前后，禾本科植物在单核早期(大麦)或单核中期(玉米、小麦)反应最好，番茄在减数分裂中期时更适宜。1、影响花药诱导频率的因素第三十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期一②花药供体植株的生长条件对花药培养反应的影响很大例如：水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗比分蘖穗花药愈伤组织的诱导率明显地提高，同步化程度高。第三十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期一③培养基是花药培养中影响花粉启动和再分化的重要条件我国科学工作者对水稻、小麦的花药培养基做了改进，研制出N6培养基。在N6培养基上，水稻花粉的出愈率大幅度提高。N6培养基的特点是铵离子浓度较低。随后，进一步降低铵盐和硝酸盐浓度，同时附加生物素，研制出C17和W14培养基，它们可以大幅度提高小麦的花药出愈率。以马铃薯提取液为基本成分的马铃薯培养液，现在被广泛地应用于小麦花药培养，效果良好。

第三十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期一培养基中的植物生长物质的种类会影响花粉发育的途径一般在禾本科植物中，常用1～5mg/L2,4-D或NAA诱导花粉愈伤组织形成，再将愈伤组织转移至降低或去除生长素或补加细胞分裂素类物质的分化培养基上，以诱导器官分化和再生植株形成。第三十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期一培养基中糖的种类对花粉胚的诱导和分化有显著影响朱至清等(1990)报道在过滤灭菌的条件下，若以0.21mg/L葡萄糖取代液体培养基中同等浓度的蔗糖，小麦花粉胚的诱导频率可增加2～10倍。一般说来，高蔗糖浓度可以抑制体细胞的生长而对花粉的生长无妨碍。最适蔗糖浓度：烟草的为3％水稻为3％～6％玉米则为12％～15％第三十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期一以1～5℃预低温处理小麦幼穗，能提高花粉愈伤组织的产量。例如，在4℃下冷冻石刁柏花蕾，预处理4天、8天和12天，愈伤组织诱导率比室温对照分别提高2.4倍、1.9和1.5倍。各种植物要求预处理的温度和时间不同。2、低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率第三十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期一小麦要求先高温培养64天之后，再转入28～30℃下培养。一直高温培养效果并不好。较高的温度虽能诱导较高频率的花粉愈伤组织，但愈伤组织分化白化苗的频率也高。控制培养温度仍是减少白化苗的一个有效措施。培养温度是影响花药反应的一个重要因素第三十九页，共五十三页，编辑于2023年，星期一3、花药培养过程花药材料的选取关键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雄发育。大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期。第四十页，共五十三页，编辑于2023年，星期一黄心乌花药培养甜椒花药培养第四十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期一草莓花药愈伤组织再生植株花药植株第四十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期一杜兰小麦的花药培养A花药在BAD-3诱导下，3周后形成胚状体和愈伤组织B另一个花药在BAC-1培养基中已愈伤组织中长出叶片C

更多的花药在BAD-3培养基上诱导出愈伤组织与子叶D

从BAC-1转移到BAD-1分化培养基中形成的愈伤组织E

在MS培养基中培养5-6周，愈伤组织开始分化根和绿色的新芽F

在MS培养基中培养7-8周，可形成大量的根和幼茎G在MS再生培养基中培养8周后，可由最初的花药形成小植株H由花药形成的健壮小植株I

花药形成的植株在同样的MS再生培养基中生长，可因培养条件改变而形成不正常的植株第四十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期一花粉植株染色体可自发加倍人工措施染色体加倍传统方法是用秋水仙素处理。较大浓度的秋水仙素溶液处理单倍体植株，时间为24～96h。浸泡试管苗方法处理芽方法浸根方法单倍体植株的二倍化第四十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期一花药培养脱毒1974年日本：花药培养可以脱除草莓病毒；花药采取时期单核期：花蕾4-6mm，花药1mm花药诱导愈伤组织培养基MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L增殖培养基MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L生根培养基1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+琼脂7g/L第四十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期一毛曼陀罗花药培养，并诱发再生植株第四十六页，共五十三页，编辑于2023年，