蛋白质的分离纯化和表征

蛋白质的分离纯化和表征第一页，共二十八页，编辑于2023年，星期一一蛋白质的酸碱性质

蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)

当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。

*蛋白质的两性电离

第二页，共二十八页，编辑于2023年，星期一第三页，共二十八页，编辑于2023年，星期一大小(一)根据化学组成测定最低相对分子质量公式:

最低相对分子质量=铁的原子量×100

铁的百分含量二蛋白质分子的大小与形状

第四页，共二十八页，编辑于2023年，星期一（二）渗透压法测定相对分子质量公式:R:气体常数T:绝对温度C:溶质浓度(g/m3)实际是测定几个不同浓度的渗透压。第五页，共二十八页，编辑于2023年，星期一(三)蛋白质的扩散和扩散系数扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。菲克定律一：

dm=-DAdcdtdxD：扩散系数。当浓度梯度为一个单位时，在一秒内通过1厘米2面积所扩散的溶质量。第六页，共二十八页，编辑于2023年，星期一菲克定律二：测定扩散系数第七页，共二十八页，编辑于2023年，星期一沉降速度法

Mr=RTsD(1-Ｖρ)

Ｖ:蛋白质的偏微比容

S：沉降系数S值

ρ：溶剂密度

D：扩散系数

(四)沉降分析法测定相对分子质量第八页，共二十八页，编辑于2023年，星期一沉降平衡法

Mr=2RTdln(c2/c1)(1-Ｖρ)Ｗ2(x22-x21)W:转头的角速度

c2，c1：离转中心x1，x2处的蛋白质浓度第九页，共二十八页，编辑于2023年，星期一(五)凝胶过滤法测定相对分子质量第十页，共二十八页，编辑于2023年，星期一（六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定

蛋白质分子质量每两个氨基酸残基结合一SDS分子后果：

1掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别。

2改变了蛋白质单体分子的构象。公式：第十一页，共二十八页，编辑于2023年，星期一形状X射线晶体结构分析第十二页，共二十八页，编辑于2023年，星期一三蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀

(一)胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。*蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜第十三页，共二十八页，编辑于2023年，星期一+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉第十四页，共二十八页，编辑于2023年，星期一（二）蛋白质的沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。第十五页，共二十八页，编辑于2023年，星期一沉淀方法*盐析(saltprecipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。*有机溶剂深沉法如乙醇,丙酮等沉淀。第十六页，共二十八页，编辑于2023年，星期一*重金属盐沉淀法析金属离子

*生物碱试剂和某些酸类沉淀法析生物碱

*加热变性沉淀法析加热

第十七页，共二十八页，编辑于2023年，星期一前处理组分级处理细分级处理四蛋白质分离纯化的一般原则

第十八页，共二十八页，编辑于2023年，星期一根据分子大小不同透析、超过滤、梯度离心、凝胶过滤根据溶解度差别等电点沉淀、PH控制、蛋白质盐溶和盐析、有机溶剂、温度根据电荷不同电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、等电聚焦、层析聚焦、离子交换层析五蛋白质分离纯化的方法

第十九页，共二十八页，编辑于2023年，星期一选择性吸附的纯化方法羟磷灰石层析、疏水作用层析对配体的特异生物学亲和力的纯化方法高效液相层析和快速蛋白质液相层析第二十页，共二十八页，编辑于2023年，星期一1几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。第二十一页，共二十八页，编辑于2023年，星期一2层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。第二十二页，共二十八页，编辑于2023年，星期一蛋白质分离常用的层析方法*离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。*凝胶过滤(gelfiltration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。第二十三页，共二十八页，编辑于2023年，星期一目录第二十四页，共二十八页，编辑于2023年，星期一目录第二十五页，共二十八页，编辑于2023年，星期一3超速离心*超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentationcoefficient,S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。第二十六页，共二十八页，编辑于2023年，星期一因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质