菊花组织培养

菊花组织培养第一页，共八十八页，编辑于2023年，星期二课题背景①植物细胞或组织，发育成完整植株，需要什么条件？②什么叫植物细胞的全能性？（1）概念：具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，具有发育成完整个体的潜能。

１.植物细胞全能性表现的条件：离体、适宜营养、一定比例的激素、无菌条件、适宜温度、光照

当植物细胞，脱离了原来所在的植物体的器官或组织，而处于离体状态时，在一定的营养物质、激素和其它外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整植株。２.植物细胞具有全能性思考（3）过程机理：在特定条件刺激下，在特定的时间和空间里，基因（遗传信息）选择性地表达出了特定的结构和功能蛋白。（2）原因：细胞内，含有某种生物全部遗传信息第二页，共八十八页，编辑于2023年，星期二基础知识思考①植物细胞全能性的表现为什么一定需要离体条件？（一）植物组织培养的过程：１、细胞的分化（必修1－第117～118页）（1）概念：在植物的个体发育过程中，由一个或一种细胞增殖的后代，在形态、结构、生理功能上发生稳定性差异的过程。

（3）机理：（2）过程：受精卵增殖、生长、分化形成组织、器官、系统基因在特定的时间和空间里，选择性地表达出了特定结构和功能的蛋白质。基因表达的程序，在个体发育的很早时期，就已经预定下来，由于机体各部位间分工协作的需要，原预定程序是不可更改的。所以，在生物体内，已经分化的细胞是不可能表现出全能性的。即在个体发育的不同时期，生物体不同部位的细胞表达的基因不同，合成了不一样的蛋白质。第三页，共八十八页，编辑于2023年，星期二（4）细胞分化的特点：①持久性：细胞分化是一种持久性的变化，一般来说，分化了的细胞将一直保持分化后的状态，直到死亡。②普遍性：由于不同生物细胞分化的机理是大致相同的，所以细胞分化现象，在具细胞结构的生物体内是一种普遍存在的生理现象。③重要性：多细胞植物体的细胞分化，是建立在有丝分裂基础上的，如果只有细胞分裂，细胞彼此一样，生物体的各部分之间，就不能进行分工协作了。正是有了细胞分化，才使多细胞生物体中的细胞趋向专门化，才能提高了机体各种生理功能的效率。③全能性：多细胞植物内已分化细胞，尽管形态、结构和功能各异，但它们都由一个细胞（如受精卵）有丝分裂来的，细胞内仍保留着某种生物的全部遗传信息，仍具有发育成完整新个体的潜能。第四页，共八十八页，编辑于2023年，星期二2、植物组织培养的基本过程离体条件下，尽管有改变细胞内原来预定的基因选择性表达程序的可能，但要让离体细胞发育成完整的植株，并不容易。离体的植物组织或细胞外植体有丝分裂脱分化愈伤组织长出丛芽生根移栽成活长成植株再分化（1）组织培养程序第五页，共八十八页，编辑于2023年，星期二（2）相关概念①外植体：从活植物体上切下，用于进行离体培养的植物器官或组织片段。②愈伤组织:细胞排列疏松而无规则,是高度液泡化的、呈无定形状态的薄壁细胞③脱分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫再分化。由高度分化的植物组织或细胞，产生愈伤组织的过程。④再分化：启动脱分化、再分化，往往需要使用植物激素，人为地进行控制；其中细胞分裂素、生长素是关键激素。第六页，共八十八页，编辑于2023年，星期二（二）影响植物组织培养的因素：1.植物材料的选择（1）不同的植物组织，培养的难易程度差别很大烟草和胡萝卜的组织培养较为容易枸杞愈伤组织的芽诱导比较难（2）同一植物材料的年龄、保存时间的长短会影响实验结果菊花的组织培养，一般选择未开花植株的茎上部，新萌生的侧枝。（内因）2.不同的离体组织和细胞对营养、环境等条件的要求相对特殊，需配置不同的培养基（外因）第七页，共八十八页，编辑于2023年，星期二MS培养基配方（P84页，附录3－八）第八页，共八十八页，编辑于2023年，星期二A、大量元素:N、P、S、K、Ca、Mg等B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Co、I、Mo等C、有机物、植物激素MS培养基主要成分包括：①你能说出各种营养物质的作用吗？②同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？思考微量、大量元素：提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖：提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质：主要是为了满足离体植物细胞对特殊营养的需求。微生物培养基，以有机营养为主。MS培养基，则需提供大量无机营养。第九页，共八十八页，编辑于2023年，星期二（1）常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素①生长素类：2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）吲哚乙酸（IAA）

萘乙酸（NAA）吲哚丁酸（IBA）②细胞分裂素类：激动素（KT）6－苄基嘌呤（6－BA）玉米素（ZT）③赤霉素类：赤霉酸（GA3）3、植物激素的影响第十页，共八十八页，编辑于2023年，星期二（2）生长素和细胞分裂素作用植物中生长素和细胞分裂素，是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势。使用顺序实验结果同时使用先使用细胞分裂素后使用生长素先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但不利分化细胞既分裂也分化分化频率提高第十一页，共八十八页，编辑于2023年，星期二生长素细胞分裂素>有利于根的分化生长素细胞分裂素<有利于芽的分化抑制根的分化生长素细胞分裂素＝促进愈伤组织生长（3）生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例对植物细胞发育方向的影响（4）pH、温度、光照进行菊花组织培养时：不同植物，对各种条件的要求往往不同。pH控制在5.8左右，温度控制在18－22OC.每日用日光灯照射12h。第十二页，共八十八页，编辑于2023年，星期二菊花组织培养的实验操作程序（一）制备MS固体培养基（二）外植体消毒（三）接种（四）培养（五）移栽（六）栽培第十三页，共八十八页，编辑于2023年，星期二实验操作（一）制备MS固体培养基配制母液→配制MS固体培养基→高压蒸汽灭菌1.配制各种母液

大量元素：浓缩10倍；微量元素：浓缩100倍；二者均常温保存激素、维生素类用量少的有机物按1mg/mL配成母液（1）一般要求

（2）配制母液的意义：①减少工作量；②减少微量试剂称量所造成的误差

第十四页，共八十八页，编辑于2023年，星期二（3）配制母液流程：称量→溶解→混合→定容→标记→保存（4OC）（2）配制母液的意义：①减少工作量；②减少微量试剂称量所造成的误差微量级分析天平微量元素大量元素有机物铁盐第十五页，共八十八页，编辑于2023年，星期二2.配制培养基，高压蒸汽灭菌

依次加入大量元素、微量元素、有机物、激素母液根据各种母液的浓缩倍数，计算用量将称好的琼脂加入800mL蒸馏水，加热，熔化琼脂加入30g蔗糖，搅拌均匀加蒸馏水定容到1000mL调节pH

分装到锥形瓶中（每瓶50mL～100mL）高压蒸汽灭菌(培养基+其他器械)立式高压灭菌锅第十六页，共八十八页，编辑于2023年，星期二1.选材：（二）外植体消毒2.消毒①流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右②酒精处理用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70％的酒精中摇动2～3次，持续6～7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗

③消毒液处理取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1～2min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液。取菊花未开花植株，茎上部生长旺盛的嫩枝

要兼顾药剂的消毒效果和外植体的耐受力幼叶、幼茎（枝）、花瓣、嫩芽等生长旺盛的幼嫩组织

花药（花粉）第十七页，共八十八页，编辑于2023年，星期二进行消毒外植体消毒液要完全浸没外植体消毒液：70%酒精、0.1%HgCl、

10%次氯酸钠消毒时间依据材料而定外植体第十八页，共八十八页，编辑于2023年，星期二（三）接种1.接种前准备

污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种环境的消毒是至关重要的。如果条件允许，接种外植体，要在超净工作台中进行，确保无菌操作。

接种前一天，用70％的酒精喷雾消毒空气，

用酒精或新洁尔灭擦试工作台，并用紫外线照射20分钟。①接种室，超净工作台的消毒②接种前，启动超净工作台，如打开吹风和照明灯开关等等。第十九页，共八十八页，编辑于2023年，星期二③做好接种准备工作在等待外植体消毒的同时，做好接种准备工作：用酒精进行桌面消毒。用酒精棉球对培养基和培养基瓶口进行消毒。准备无菌纸点燃酒精灯第二十页，共八十八页，编辑于2023年，星期二2.接种时的无菌操作要求接种操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。灼烧接种工具时，要注意安全第二十一页，共八十八页，编辑于2023年，星期二①将装有培养基的锥形瓶整齐地排列在酒精灯左侧。②将消过毒的菊花茎段，在无菌培养皿中切成小段（长约0.5～1cm）。③左手持锥形瓶，右手拉开捆扎锥形瓶的绳子，并将封口膜攥于右手心，以避免封口膜接触瓶口的一面被污染。④左手持锥形瓶，瓶口旋转通过火焰；右手用镊子夹取菊花茎段插入培养基中（不要倒插）⑤接种后，将封口膜重新扎好⑥瓶外壁贴上标签：植物名称、接种日期、姓名等3.接种过程第二十二页，共八十八页，编辑于2023年，星期二接种后，在酒精灯火焰上转动灼烧瓶口，加盖贴标签：植物名称接种日期姓名等第二十三页，共八十八页，编辑于2023年，星期二【接种注意事项】①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为70％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件③插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基，利于吸收水分和养分第二十四页，共八十八页，编辑于2023年，星期二（四）培养

接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，培养期间应定期消毒。培养温度控制在18～200C，并且每日用日光灯光照12h.1、愈伤组织的培养2周后，培养基成分接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养（即分瓶扩大培养）.从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。2周之内可以看到，外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长的更快。第二十五页，共八十八页，编辑于2023年，星期二愈伤组织开始分化愈伤组织培养室里培养箱中的培养第二十六页，共八十八页，编辑于2023年，星期二2.愈伤组织的继代培养（切割、分瓶扩大培养）

继代培养所用的培养基与培养愈伤组织的相同，在严格的无菌条件下，将愈伤组织连同原来的外植体一起移到新培养基上，进行继代培养。

继代培养一代为20d。若时间过长，因培养基中营养物质减少，外植体会分泌有毒物质，造成自身中毒。

如果愈伤组织长到直径为1～1.5cm时，就可以进行试管苗培养，否则还需进行第二代继代培养.

继代培养期间恒温箱的门要打开，让愈伤组织见光，见光后，愈伤组织颜色逐渐转为绿色3.试管苗的培养愈伤组织长到直径为1～1.5cm时，更换培养基，进行试管苗的见光培养.第二十七页，共八十八页，编辑于2023年，星期二切割、分瓶扩大繁殖第二十八页，共八十八页，编辑于2023年，星期二无菌室里超净工作台上的切割过程第二十九页，共八十八页，编辑于2023年，星期二（五）移栽（练苗、移栽、栽培）在移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日.1.打开封口膜：2.清洗转移：用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间3.移栽：幼苗长壮后，移栽到土壤中珍珠岩：是一种火山喷发的酸性熔岩，经急剧冷却而成的玻璃质岩石，有弧形或圆形裂隙，如珍珠的结构，所以被命名为珍珠岩。是一种天然、无毒，在高温作用下会膨胀比较少见的矿物质。属于硅酸盐。

蛭石：特点：固体基质，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培练苗移栽栽培第三十页，共八十八页，编辑于2023年，星期二六、炼苗、移栽移植到消过毒的蛭石或珍珠岩上的幼苗长在蛭石和珍珠岩上的幼苗第三十一页，共八十八页，编辑于2023年，星期二（六）栽培

幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花第三十二页，共八十八页，编辑于2023年，星期二1、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）2、外植体的消毒（酒精、氯化汞）3、接种的无菌操作（酒精、酒精灯——灼烧）4、无菌箱中的培养；5、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？第三十三页，共八十八页，编辑于2023年，星期二你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？设置对照实验，可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。思考第三十四页，共八十八页，编辑于2023年，星期二2.外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。练习第36页－练习题11.植物组织培养所利用的植物材料，体积小、抗性差，对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基，同样适合于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。第36页－练习题2第三十五页，共八十八页，编辑于2023年，星期二(1)培育无病毒植株4、植物组织培养的应用：(2)实现优良品种的快速繁殖，保持遗传性状的一致(3)实现花卉的连续生产，不受季节的限制因为，植物的根尖，芽尖的分生组织，由于细胞分裂、增殖快，常常没有病毒；以此为外植体，通过组织培养繁殖而的植株，一般没有病毒。因为，花卉组织培养是在实验室中进行，条件是可控的。第三十六页，共八十八页，编辑于2023年，星期二(4)培养紫草愈伤组织,提取紫草素（治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）(6)基因工程中亦需用到植物组织培养的方法(5)诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子，可以解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题.第三十七页，共八十八页，编辑于2023年，星期二三、课题延伸1、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养2、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季第三十八页，共八十八页，编辑于2023年，星期二此时的组织或细胞为离体的，即细胞所生活的环境为液体有机物营养环境，而不是能体现其整个植物体的光能自养在培养过程中，是脱分化、再分化的过程，随着芽和根的形成，就具有了自养的能力，是由细胞到一个个体的演变过程1、高等植物是光能自养型生物，为什么在植物组织培养过程中还需要提供有机物培养基？2、培养过程中为什么需要进行光照思考？第三十九页，共八十八页，编辑于2023年，星期二1、外植体带菌2、培养基及接种器具灭菌不彻底3、接种操作时带入4、环境不清洁结合录像外植体灭菌与接种操作，谈谈组织培养污染的主要途径及怎样预防污染？第四十页，共八十八页，编辑于2023年，星期二第四十一页，共八十八页，编辑于2023年，星期二菊花的组织培养JLSSYBYH第四十二页，共八十八页，编辑于2023年，星期二第四十三页，共八十八页，编辑于2023年，星期二第四十四页，共八十八页，编辑于2023年，星期二

菊花是菊科菊属的多年生宿根草本植物,是我国的传统名花和世界四大切花之一长期以来菊花采用分株、扦插等无性繁殖方法进行繁殖但是传统的繁殖方法易受环境影响,繁殖周期长,随着市场需求的急剧增加,已经不能满足市场日益发展的需要。植物组织培养具有增殖效率高、繁殖速度快的特点,可以用较短的时间和较少的空间生产出大量的试管苗第四十五页，共八十八页，编辑于2023年，星期二扦插嫁接压条

第四十六页，共八十八页，编辑于2023年，星期二（四）培养1、愈伤组织的培养从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。2周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长的更快。2周后，培养基成分接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养第四十七页，共八十八页，编辑于2023年，星期二继代培养所用的培养基与培养愈伤组织的相同，在严格的无菌条件下，将愈伤组织连同原来的外植体一起移到新培养基上。愈伤组织的继代培养一代为20d。如果延长时间，培养基中营养物质减少，外植体会分泌有毒物质，造成自身中毒。如果愈伤组织长到直径为1－1.5cm时，就可以进行试管苗培养，否则还需进行第二代继代培养2、愈伤组织的继代培养在愈伤组织继代培养期间，将恒温箱的门打开，让愈伤组织见光，愈伤组织见光后颜色可以转为绿色第四十八页，共八十八页，编辑于2023年，星期二3、试管苗的培养当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗的见光培养（五）移栽移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日1、打开封口膜2、清洗转移用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间第四十九页，共八十八页，编辑于2023年，星期二同常规的无性繁殖方法相比，组织培养快速繁殖法主要具有以下优点：（1）快速。采用常规的方法如分株法，一棵花卉一年一般只能生产几株或几十株，但用组织培养的方法则每年可以繁殖出几万甚至数百万的小植株。（2）周年生产。花卉组织培养快速繁殖是在实验室中进行，因条件可控，所以不受季节限制，可以全年进行连续生产。而常规的无性繁殖则受季节限制，只能在花卉生长季节进行繁殖。（3）经济效益高。花卉组织培养快速繁殖所需要的空间小，在一个200平方米的培养室内一年可生产试管苗上百万株。如按每株1元计算，每年产值上百万元。（4）以组织培养繁殖的种苗与母株有著相同的遗传基因。所以使用这项技术可让优良的品种不断地延续。组织培养与常规繁殖相比优点众多第五十页，共八十八页，编辑于2023年，星期二植物组织培养过程示意图2、上面的示意图中还有什么地方不够完善的？没有进行灭菌处理，试管也没有做密封等。第五十一页，共八十八页，编辑于2023年，星期二专题3课题1菊花的组织培养第五十二页，共八十八页，编辑于2023年，星期二试评价下列操作正确与否第五十三页，共八十八页，编辑于2023年，星期二第五十四页，共八十八页，编辑于2023年，星期二本课题内容小结菊花组织培养基础知识实验操作植物体的组织培养影响组织培养的因素细胞分化细胞全能性组织培养过程营养激素环境条件MS固体培养基制备外植体消毒接种培养移栽栽培第五十五页，共八十八页，编辑于2023年，星期二作业：P36

1、在植物组织培养过程中，为什么要进行一系列的消毒、灭菌，并且要求无菌操作。2、在选取菊花茎段是，为什么要选取生长旺盛的嫩枝？第五十六页，共八十八页，编辑于2023年，星期二第五十七页，共八十八页，编辑于2023年，星期二第五十八页，共八十八页，编辑于2023年，星期二三、接种外植体1.前期准备启动超净工作台（打开吹风和照明灯开关）第五十九页，共八十八页，编辑于2023年，星期二在等待外植体消毒的同时，做后面的准备工作—如点燃酒精灯、用酒精棉进行培养基和培养基瓶口的消毒、桌面的酒精消毒、准备无菌纸等。第六十页，共八十八页，编辑于2023年，星期二倒掉消毒液用无菌水反复冲洗多次第六十一页，共八十八页，编辑于2023年，星期二灼烧接种工具，注意安全2.在酒精灯旁操作进行外植体切割和接种第六十二页，共八十八页，编辑于2023年，星期二在无菌纸上切割外植体第六十三页，共八十八页，编辑于2023年，星期二灼烧瓶口和镊子第