蛋白质双向电泳原理方法应用

蛋白质双向电泳原理方法应用第一页，共六十三页，编辑于2023年，星期二

双向电泳的实验原理◆第一向：等电聚焦◆第二向：SDS—PAGE电泳第二页，共六十三页，编辑于2023年，星期二第一向：等电聚焦第三页，共六十三页，编辑于2023年，星期二第二向：SDS—PAGE电泳聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺(Arc)和交联剂N,N-甲叉丙烯酰胺(Bis)在加速剂N,N,N’—四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂硫酸铵（AP）或核黄素的作用下聚合交联成三维网状的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为PAGE。第四页，共六十三页，编辑于2023年，星期二第五页，共六十三页，编辑于2023年，星期二第六页，共六十三页，编辑于2023年，星期二样品制备基本原则使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。第七页，共六十三页，编辑于2023年，星期二双向电泳样品的溶解是成功进行双向电泳的最关键因素之一溶解的目标：样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液；必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；保证样品在电泳过程中保持溶解状态。第八页，共六十三页，编辑于2023年，星期二增加样品溶解性的手段离液剂（变性剂）：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。典型代表是尿素和硫尿。去垢剂（表面活性剂）：经过离液剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种去垢剂来溶解疏水基团。常用的去垢剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂TritonX-100和NP-40、两性离子去垢剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS应用最普遍。还原剂：在离液剂和去垢剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。第九页，共六十三页，编辑于2023年，星期二起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。第十页，共六十三页，编辑于2023年，星期二聚焦时间的优化要获得高质量的图谱以及很好的试验重复性，所需的最佳时间即为等电聚焦达到稳定态所需的时间。聚焦最佳时间由不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。第十一页，共六十三页，编辑于2023年，星期二两维间的平衡等电聚焦电泳结束后可马上进行第二向电泳，也可于－80°保存数月。但在第二向电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而使SDS电泳能顺利进行。建议方案：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mMTris（pH8.8）缓冲液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述缓冲液平衡15min。如果用TBP代替DTT则只需一步平衡。第十二页，共六十三页，编辑于2023年，星期二聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测理想显色剂的7S安全（safety）：灵敏（sensitivity）：简单（simplicity）：特异性（specificity）：快速（speed）：稳定（stability）：兼容性（synergy）：第十三页，共六十三页，编辑于2023年，星期二适用于质谱的染色方法考马斯亮兰（Bio-Safe™Coomassie™colloidal250stain）银染（SilverStainPlus™stain）荧光染色（SYPRO®Rubyproteingelstain）第十四页，共六十三页，编辑于2023年，星期二凝胶的图像处理分析典型流程凝胶图像的扫描：图像加工：斑点检测和定量：凝胶配比：数据分析：数据呈递和解释：2-DE数据库的建立：第十五页，共六十三页，编辑于2023年，星期二双向电泳实验流程

样品制备（Samplepreparation）固相预制胶条的水化（IPGstriprehydration）第一向等电聚焦（IEF）胶条的平衡（IPGstripequilibration）第二向SDS电泳（SDSelectrophresis）凝胶的染色及检测（Detection/Staining）PDQuest软件分析（Softwareanalysis）质谱鉴定（Proteinidentification）第十六页，共六十三页，编辑于2023年，星期二最高电压10,000V10–25C温度控制7,11,17,18,和

24cm的聚焦盘，可以各放12根胶条可以储存10个程序，每个程序有10步程序可进行时时编辑可供选配的打印机第十七页，共六十三页，编辑于2023年，星期二等电聚焦的操作1.取出IPG预制胶条（7cmpH4-7），室温平衡。2.在聚焦盘或水化盘中加入样品（图1）。3.去除预制IPG胶条上的保护层（图2）。4.将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中（图3）。5.在每根胶条上覆盖1ml矿物油。6.对好正、负极，盖上盖子。7.设置等电聚焦程序。第十八页，共六十三页，编辑于2023年，星期二第十九页，共六十三页，编辑于2023年，星期二等电聚焦的操作1.取出IPG预制胶条（7cmpH4-7），室温平衡。2.在聚焦盘或水化盘中加入样品（图1）。3.去除预制IPG胶条上的保护层（图2）。4.将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中（图3）。5.在每根胶条上覆盖1ml矿物油。6.对好正、负极，盖上盖子。7.设置等电聚焦程序。第二十页，共六十三页，编辑于2023年，星期二第二十一页，共六十三页，编辑于2023年，星期二等电聚焦的操作1.取出IPG预制胶条（7cmpH4-7），室温平衡。2.在聚焦盘或水化盘中加入样品（图1）。3.去除预制IPG胶条上的保护层（图2）。4.将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中（图3）。5.在每根胶条上覆盖1ml矿物油。6.对好正、负极，盖上盖子。7.设置等电聚焦程序。第二十二页，共六十三页，编辑于2023年，星期二第二十三页，共六十三页，编辑于2023年，星期二等电聚焦的操作1.取出IPG预制胶条（7cmpH4-7），室温平衡。2.在聚焦盘或水化盘中加入样品（图1）。3.去除预制IPG胶条上的保护层（图2）。4.将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中（图3）。5.在每根胶条上覆盖1ml矿物油。6.对好正、负极，盖上盖子。7.设置等电聚焦程序。第二十四页，共六十三页，编辑于2023年，星期二胶条的平衡冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟。配制胶条平衡缓冲液I。吸去胶条上的矿物油及多余的样品。第一次平衡。振荡15分钟。配制胶条平衡缓冲液II。第二次平衡，振荡15分钟。吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1×电泳缓冲液。第二十五页，共六十三页，编辑于2023年，星期二胶条的转移平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1×电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上（图4、图5）。将放有胶条的SDS凝胶转移到灌胶架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液（图-6）。用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触（图-7）。放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。第二十六页，共六十三页，编辑于2023年，星期二第二十七页，共六十三页，编辑于2023年，星期二胶条的转移平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1×电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上（图4、图5）。将放有胶条的SDS凝胶转移到灌胶架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液（图-6）。用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触（图-7）。放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。第二十八页，共六十三页，编辑于2023年，星期二第二十九页，共六十三页，编辑于2023年，星期二胶条的转移平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1×电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上（图4、图5）。将放有胶条的SDS凝胶转移到灌胶架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液（图-6）。用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触（图-7）。放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。第三十页，共六十三页，编辑于2023年，星期二第三十一页，共六十三页，编辑于2023年，星期二胶条的转移平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1×电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上（图4、图5）。将放有胶条的SDS凝胶转移到灌胶架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液（图-6）。用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触（图-7）。放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。第三十二页，共六十三页，编辑于2023年，星期二第三十三页，共六十三页，编辑于2023年，星期二胶条的转移平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1×电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上（图4、图5）。将放有胶条的SDS凝胶转移到灌胶架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液（图-6）。用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触（图-7）。放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。第三十四页，共六十三页，编辑于2023年，星期二SDS电泳1.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。2.在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/7cm），待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（15-20mA/gel/7cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。3.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。第三十五页，共六十三页，编辑于2023年，星期二双向电泳技术的应用第三十六页，共六十三页，编辑于2023年，星期二第三十七页，共六十三页，编辑于2023年，星期二双向电泳技术在病原微生物致病机理研究中的应用第三十八页，共六十三页，编辑于2023年，星期二

双向电泳技术在人类恶性肿瘤研究中的进展人们通过双向电泳技术分离正常组织细胞与肿瘤之间的差异蛋白质组分，在寻找肿瘤的特异标志物、揭示肿瘤的发病机制以及开发新的肿瘤治疗方式和治疗药物提供理论依据等方面都取得了一些重要的进展。肿瘤发生的早期常常无任何症状，而只有在转移时才容易被发现，这往往导致延误了治疗的最佳时期。因此找到肿瘤早期的标志物进行及时的诊断和治疗显得尤为重要。

第三十九页，共六十三页，编辑于2023年，星期二双向电泳技术在药物作用机制研究的进展

双向电泳技术的出现，为动态、高通量的研究药物作用机制提供了强有力的方法支持。双向电泳技术的另一应用就是研究药物的毒理作用。比较正常细胞与药物处理后细胞的蛋白质表达丰度变化，可以提示药物的毒性作用机制。细胞在施药之后的代谢反应做出实时的检测，不仅能确定疗效，也能针对毒性代谢物质的发现而对药物进行直接的改良，是一项意义深远的发现。第四十页，共六十三页，编辑于2023年，星期二Westernblot原理方法及应用第四十一页，共六十三页，编辑于2023年，星期二定义印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。WesternBlot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法。第四十二页，共六十三页，编辑于2023年，星期二什么是蛋白质印迹法？Westernblot法是凝胶电泳技术、固定化技术及分子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在于把凝胶已分离的区带并印迹于固化纸上，可分为电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。Westernblot法结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定的方法。第四十三页，共六十三页，编辑于2023年，星期二WesternBlot基本原理

WesternBlot：采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。第四十四页，共六十三页，编辑于2023年，星期二WesternBlot一般流程第四十五页，共六十三页，编辑于2023年，星期二蛋白样品的制备第四十六页，共六十三页，编辑于2023年，星期二蛋白样品制备的注意事项：细胞数量达5×106个时就可以做WB。将细胞裂解液再离心，收集上清液测蛋白浓度（Bca法）,统一上样量加loadingBUFFER煮样5min-10min煮沸5-15min，以充分变性蛋白，保证蛋白从空间结构变为一级结构（多聚体解散为单聚体，氧化状态转化为还原状态等）。有的也可以在700C加热5-10min，尤其适用于多次跨膜蛋白的检测（这些蛋白在煮沸状态下容易聚集，而聚集状态则会影响标本进入凝胶的效率。）第四十七页，共六十三页，编辑于2023年，星期二SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：SDS是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1:1.4(以重量为单位),而蛋白质和SDS结合后,由于SDS带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量的蛋白质带电价一致(chargedensity),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素第四十八页，共六十三页，编辑于2023年，星期二第四十九页，共六十三页，编辑于2023年，星期二凝胶成份纯净水（ddH2O）丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺（Arc-Bis）SDSTris-HCL四甲基乙二胺(TEMED)（催化硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合）过硫酸铵(APS)（提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由基）第五十页，共六十三页，编辑于2023年，星期二转膜膜的选择聚偏二氟乙烯膜（PVDF）硝酸纤维素膜（NC）需要用甲醇浸泡简单快速封闭非特异性抗体结合价格昂贵价格便宜第五十一页，共六十三页，编辑于2023年，星期二膜的选择第五十二页，共六十三页，编辑于2023年，星期二转膜半干法（用恒流）将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转1h或过夜。

第五十三页，共六十三页，编辑于2023年，星期二转膜注意事项（一）泡膜： 转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移buffer浸泡20min

（1.凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形。2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡）

转膜顺序：阴极碳板(黑)+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板（白）转膜条件： 0.4A250V1h-90min冰浴中进行转膜

（具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，反之则短。）

第五十四页，共六十三页，编辑于2023年，星期二转膜的注意事项（二）避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。第五十五页，共六十三页，编辑于2023年，星期二封闭（1h）(封闭时间过短会导致背景过深

)5％脱脂奶粉封闭1h，置于摇床上。封闭前，要用双蒸水洗3-5min,剪膜第五十六页，共六十三页，编辑于2023年，星期二

WesternBlotting操作流程第五十七页，共六十三页，编辑于2023年，星期二一抗、二抗孵育把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料盒中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入一抗溶液与滤膜温育（