血红蛋白的提取和分离

血红蛋白的提取和分离第一页，共六十二页，编辑于2023年，星期二

21世纪初，工程浩大的国际人类基因组计划正式完成，但仅仅测绘出基因组序列还远远不够，必须对基因组的编码产物——蛋白质组进行深入的研究才能真正实现基因诊断和基因治疗，近年来，我国科学家在蛋白质组研究领域取得了令人瞩目的成绩，首次由我国科学家领导的国际重大科研合作项目人类肝脏蛋白质组计划已经取得阶段性进展。我国蛋白质组研究取得突破性进展/kid/wzxqt/2012-8-2/134388789376.shtml第二页，共六十二页，编辑于2023年，星期二人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息。蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究第三页，共六十二页，编辑于2023年，星期二思考

蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。第四页，共六十二页，编辑于2023年，星期二（一）蛋白质提取和分离的原理一

基础知识根据蛋白质各种特性的差异：P64分子的形状大小；电荷性质和多少；溶解度；吸附性质；对其他分子亲和力

（二）蛋白质提取和分离的方法1.凝胶色谱法（分配色谱法）；2.电泳法色谱法：也叫层析法，是指利用混合物中各组分理化性质的不同，使各组分以不同程度分布进而实现分离的技术。如：绿叶中色素的提取和分离第五页，共六十二页，编辑于2023年，星期二阅读并回答（P64）

1、凝胶色谱法分离蛋白质的依据；

2、凝胶的实质；

3、凝胶色谱法的原理。基础知识（三）凝胶色谱法第六页，共六十二页，编辑于2023年，星期二（三）凝胶色谱法P641.分离依据：不同蛋白质的相对分子质量不同

2.凝胶的结构：微小的多孔球体，内部有许多贯穿的通道；具多孔的凝胶就叫“分子筛”3.凝胶的化学组成：多糖类化合物，如葡聚糖或琼脂糖第七页，共六十二页，编辑于2023年，星期二当蛋白质混合物通过装填了凝胶的色谱柱时相对分子质量较小相对分子质量较大凝胶内部的通道容易进入无法进入凝胶内部的通道只能在凝胶外部移动路程较长移动速度较慢路程较短移动速度较快相对分子质量较大的蛋白质先从色谱柱中洗脱出来,相对分子质量较小的蛋白质后洗脱出来4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理—分子筛效应第八页，共六十二页，编辑于2023年，星期二第九页，共六十二页，编辑于2023年，星期二凝胶色谱法分离蛋白质的原理第十页，共六十二页，编辑于2023年，星期二相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个B第十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期二1、我们在什么地方遇到过缓冲物质的？2、缓冲物质有哪些？3、缓冲溶液的作用是什么？4、怎样配制缓冲溶液？基础知识（四）缓冲溶液第十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期二H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等（四）缓冲溶液——洗脱剂P65

1.概念一定范围内，能够抵制外加少量强酸或强碱的影响，使原来溶液pH值基本保持不变的混合溶液。2.配制通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。思考：你还记得人体血液中的缓冲物质吗？第十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期二2.你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)。生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，就必须保持体外的pH与体内的基本一致。因此，缓冲溶液的正确配制和pH的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极其重要的意义。思考：

1.在生物化学的研究工作，为什么要正确配制缓冲溶液和准确测定缓冲溶液的pH？第十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期二基础知识（五）电泳第十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期二阅读第65-66页的相关内容，回答以下问题：

1、电泳的概念；

2、电泳的原理；

3、电泳的种类；

4、SDS的作用。基础知识（五）电泳第十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期二1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理：3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。（五）电泳P65--66待分离样品带电性质的差异大小、形状的不同各种带电分子产生不同的迁移速度而分离①多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。第十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期二4实例：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)用途:

测定蛋白质分子量（鉴定蛋白质纯度）(2)聚丙烯酰胺凝胶：单体丙烯酰胺+N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(交联剂)

→聚合交联→具有三维网状结构的凝胶注意:

SDS能使蛋白质完全变性，使蛋白质复合体解聚成单条肽链，故测得的蛋白质分子量实质上是单条肽链的分子量。SDS：十二烷基硫酸钠第十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期二(3)原理:P66②SDS与蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过蛋白质分子原有电荷量，使蛋白质在SDS—聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移速率完全取决于蛋白质分子的大小。①

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。正极，因为凝胶中的蛋白质带负电荷思考：若将蛋白质样品加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，在电场作用下，蛋白质会往哪个电极迁移？第十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期二使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异第二十页，共六十二页，编辑于2023年，星期二讨论：如何测定蛋白质的分子量？使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售第二十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期二不同。①凝胶色谱法是根据相对分子质量大小分离蛋白质;②电泳法是根据各种分子性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现在电场中将各种分子分离。思考：凝胶色谱法和电泳法分离蛋白质的原理相同吗？第二十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期二二

实验操作血液组成(1)洗涤红细胞(2)释放血红蛋白(3)分离血红蛋白溶液样品处理粗分离纯化纯度鉴定透析：除去分子较小的杂质凝胶色谱法：除去杂蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：鉴定血红蛋白纯度、测定分子量第二十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期二思考人们用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？哺乳动物的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。二

实验操作

本课题可选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液来分离血红蛋白。选材第二十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期二第二十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期二红细胞的主要组成水血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团血红蛋白特点：每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。第二十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期二蛋白质占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物2、组成元素C、H、O、N复习1、含量3、相对分子质量高分子化合物4、基本组成单位氨基酸5、氨基酸通式RHCCOOHNH2第二十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期二6、氨基酸的结合方式CHCOOHR1CHNH2COOHR2NH2COHNHOH第二十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期二氨基酸的结合方式CHR1NH2OHCOH2OCHCOOHR2HNH第二十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期二氨基酸的结合方式:CHR1NH2COCHCOOHR2HNH2O二肽肽键脱水缩合第三十页，共六十二页，编辑于2023年，星期二氨基酸的结合方式:脱水缩合肽键CHCOOHR3HNOHHCCHR1NH2COCHR2HNO二肽H2OH2O第三十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期二氨基酸的结合方式:脱水缩合CCHR1NH2COCHR2HNO肽键二肽CHCOOHR3HNH2O肽键三肽以此类推，由多个氨基酸分子缩合而成的含有多个肽键的化合物，叫多肽（链状）。肽链盘曲，折叠，形成有一定空间结构的蛋白质分子。H2O第三十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期二8、分子结构7、肽键CONH氨基酸肽链蛋白质脱水缩合盘曲折叠（一条或者多条）第三十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期二10、生理功能细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切生命活动的主要承担者氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别9、蛋白质结构的多样性第三十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期二①氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个②若有n个氨基酸分子缩合成m条肽链,则可形成________个肽键,脱去______个水分子，至少有氨基和羧基各____个11、相关计算n-mn-mm思考：血红蛋白共有574个氨基酸，4条肽链，至少有氨基、羧基多少？第三十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期二③蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结构第三十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期二第三十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期二④关于蛋白质相对分子量的计算：n个氨基酸形成m条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,那么由此形成的蛋白质的相对分子量为______________n·a-(n-m)·18第三十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期二血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色1、洗涤红细胞(2)洗涤过程（一）样品处理（1）洗涤目的:去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。第三十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期二1、速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果。问：1、洗涤操作过程中，为什么要低速短时间离心？2、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？3、用质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤，能否用蒸馏水或浓度高的氯化钠溶液？为什么？1、红细胞的洗涤2、重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。

（一）样品处理第四十页，共六十二页，编辑于2023年，星期二2、血红蛋白的释放：

加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯

，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟,细胞破裂释放出血红蛋白。磁力搅拌器搅拌器转子蒸馏水：使红细胞吸水胀破甲苯：溶解红细胞的细胞膜充分搅拌的目的：加速红细胞的破裂第四十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期二搅拌器正在工作第四十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期二红细胞破碎混合液高速离心10min离心管滤纸过滤脂类物质烧杯3分离血红蛋白第四十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期二20mmol/L磷酸缓冲液（二）透析血红蛋白——粗分离透析的目的：去除血红蛋白溶液中的小分子杂质透析的原理：

透析袋是半透膜，能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。透析袋透析的过程：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h。第四十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期二1.凝胶色谱柱的制作2.凝胶色谱柱的装填3.样品的加入和洗脱（三）血红蛋白的纯化-凝胶色谱操作第四十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期二1凝胶色谱柱的制作①主体：取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端用砂纸磨平。③底塞(带样品出口)：

橡皮塞上部打孔挖出凹穴安装移液管头部(样品出口)在凹穴上方依次覆盖尼龙网和尼龙纱，包好②顶部：安装了玻璃管的橡皮塞第四十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期二2凝胶色谱柱的装填(1)计算凝胶用量(3)配制凝胶悬浮液计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水中充分溶胀。(2)凝胶的选择：交联葡聚糖凝胶(G-75）“G”:

凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75：凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g第四十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期二(5)洗涤平衡：

装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。(4)装填凝胶悬浮液：

将色谱柱固定在支架上，将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻敲色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。第四十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期二①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。

②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。

③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。

④洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）

注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、使吸管管口沿管壁环绕移动。3样品的加入和洗脱第四十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期二正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。第五十页，共六十二页，编辑于2023年，星期二加样(蛋白质混合物)洗脱(缓冲液)收集(分离)缓冲液第五十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期二缓冲液出样口加样第五十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期二样品的加入和洗脱的操作不正确的是A．加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D．用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

A

第五十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期二分子向阳极移动阳极水平电泳------DNA的分离（四）纯度鉴定-----SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳第五十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期二垂直电泳装置---用于蛋白质分离鉴定第五十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期二加样：用移液器吸取样品后，将样品加入加样孔中样品迁移方向加样孔(嵌入凝胶一端)凝胶(没入电解缓冲液中)电极SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳第五十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期二电泳过程中分子迁移的规律：小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品凝胶按分子大小分离电泳方向电泳小分子大分子第五十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期二思考：如何测定未知种类蛋白质的分子量？使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电