绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达课件

绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达概览GFPpEGFP-N3和pET-28a实验内容实验目的实验原理实验过程GFP绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein,简称GFP)GFP基因来源于JellyfishAequoreaVictoria，是Shimomura等于1962年发现的蛋白质，由238个氨基酸组成，分子量约为27Kd。GFP在包括热、极端PH和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定在荧光显微镜下，用波长约490nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测；无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率；蛋白本身性质稳定；可在多种异源生物中表达且无细胞毒性；其基因片段长度较小(约717bp)，易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性EGFP是一种优化的突变型GFP，使其产生的荧光较普通GFP强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度。EGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子。GFP丝氨酸－酪氨酸－甘氨酸生色基团蛋白质折叠，生色基团得以“亲密接触”,经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。但此时还不能发射荧光,只有当有分子氧存在的条件下,发生氧化脱氢,方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”,形成可发射荧光的形式。GFP蓝光、绿光与黄光基因克隆变体GFP分子标记药物筛选融合抗体生物传感器信号传导标记！pEGFP-N3真核细胞表达载体，pEGFP-N3载体上携带有EGFP蛋白表达基因很强的复制能力高效的功能强大的启动子SV40和PCMV多克隆位点具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞pEGFP-N3pET-28apET系统（pET-28a）原核蛋白表达引用最多的系统在任何E.coli表达系统中，基础表达水平最低真正的调节表达水平的“变阻器”控制提供各种不同融合标签和表达系统配置具有可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌许多载体以LIC载体试剂盒方式提供，用于迅速定向克隆PCR产物许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化E.ColiBL21（DE3）表达菌株表达载体和宿主菌的选择E.ColiBL21（DE3）是表达宿主菌实验内容得到重组质粒pET-28a-GFP转入表达菌株E.ColiBL21（DE3）经培养后用IPTG进行三个时间梯度的诱导表达GFP，紫外线下观察实验目的掌握重组蛋白的基因表达和蛋白检测设计思想学习分子生物学实验主要操作技术实验原理实验器材与仪器实验仪器实验材料实验试剂实验思路实验步骤将pET-28a-GFP重组质粒转化入表达菌株·制备BL21（DE3）菌株的感受态细胞

10uLBL21（DE3）菌液接入3mLLB液体培养基，摇床培养过夜二次活化：1:50比例接入新的试管摇床培养2h1.5mL冰上10min

4度，4000r/min离心2min收集细胞弃培养液，加入预冷的Cacl2液600uL，轻悬，冰上20min，4度，4000r/min离心2min弃上清液，加入预冷的Cacl2液500uL，轻悬，冰上5min，4度，4000r/min离心2min弃上清液，加入预冷的Cacl2液300uL，轻悬，即可·将pET-28a-GFP重组质粒转入BL21（DE3）菌中300uL分成3份，2份分别加入重组质粒2uL，轻匀，冰上30min；1份平行操作（对照）42度水浴热击90S，迅速冰上冷却5min两管中分别加入LB液体培养基100uL，匀，37度振荡培养30~60min涂平板：a）分别取50、100、150uL加入重组质粒的感受态细胞悬液涂布于含抗生素的平板b）抗生素板+IPTG+100uL重组质粒的感受态细胞悬液c）对照组感受态细胞100uL+抗生素平板d）正面向上放置片刻，后37度倒置培养20hIPTG诱导重组蛋白的表达重组阳性克隆菌接至3mLLB（Kan）液体培养基中，37度培养16h过夜菌1:50比例接种至4支试管中（每支试管含3mLLB(Kan)），扩大培养2h，测量A600值为0.5，停止分别使用IPTG（最后总浓度为1mmol/L）诱导0,2,4h离心并照相Wisha