第二章-基因工程制药课件

第二章基因工程制药

谢谢你的阅读2019年10月14第一节概述

第二节目的基因的获得

第三节基因表达

第四节基因工程菌的不稳定性

第五节基因工程菌中试

第六节重组工程菌的培养

第七节基因工程药物的分离纯化

第八节变性蛋白的复性

第九节基因工程药物的质量控制

第二章基因工程制药

谢谢你的阅读2019年10月14

一、基因工程技术生产药品的优点二、基因工程药物生产的基本过程三、国内外基因工程药物研究进展

第一节概述谢谢你的阅读2019年10月14第一节概述基因工程技术诞生：20世纪70年代现代生物技术的发展

基因工程：

应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物遗传性，创造新的生物物种，通过工程化手段为人类提供有用产品和服务的技术。谢谢你的阅读2019年10月14一、基因工程技术生产药品的优点

1.大量生产过去通过常规生化分离提取技术难以获得（富集）的生理活性蛋白和多肽。

2.提供足够数量的生理活性物质。3.开发更多的内源性生理活性物质。4.通过基因工程和蛋白质工程对天然生理活性物质进行改造，优化天然的生理活性物质。5.利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。

6.降低成本，提高产品质量。谢谢你的阅读2019年10月14二、基因工程药物生产的基本过程1.目的基因的获得2.构建DNA重组体上游技术3.构建工程菌4.工程菌的发酵5.外源基因表达产物的分离纯化6.产品的检验谢谢你的阅读2019年10月14谢谢你的阅读2019年10月14三、国内外基因工程药物研究进展

目前研制的基因工程药物主要包括:

1.免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体;

2.细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子表皮生长因子、凝血因子；

3.激素，如胰岛素、生长激素、心钠素；

4.酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶激活剂、超氧化物歧化酶等。谢谢你的阅读2019年10月14VitaminA谢谢你的阅读2019年10月14

第二节目的基因的获得

一、反转录法二、化学合成法

谢谢你的阅读2019年10月14一、反转录法

1．mRNA的纯化

（1）选择表达目的蛋白质丰度高的mRNA的生物材料。（2）分离总RNA。（3）分离mRNA（多聚T纤维素）谢谢你的阅读2019年10月142．cDNA第一链的合成（RT-PCR，随机引物）3．cDNA第二链的合成4．cDNA克隆5．将重组体导入宿主细胞一、反转录法谢谢你的阅读2019年10月146．cDNA文库的鉴定一、反转录法谢谢你的阅读2019年10月147．目的cDNA克隆的分离和鉴定

一、反转录法谢谢你的阅读2019年10月14优点：准确性高、人工接头、改进、利用局限性：1．小分子量的蛋白或多肽2．已知核苷酸顺序或氨基酸顺序3．费用较高

二、化学合成法谢谢你的阅读2019年10月14VitaminB2

基因表达的成败，直接影响药品的质量、成本。基因表达是外源基因在生物体转录、翻译以及所有加工过程，是外源基因异源转录翻译利用宿主功能的过程，也是外源DNA、RNA、Pr克服宿主细胞

进攻，保护自身的过程。第三节基因表达谢谢你的阅读2019年10月14

1.原核细胞（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等）

2.真核细胞（酵母、丝状真菌、动物细胞等）一、宿主菌的选择谢谢你的阅读2019年10月14

1．原核细胞（1）大肠杆菌

优点：遗传背景清晰，生长迅速。缺点：①胞内表达，提取困难。②包含体形式，需复性。③表达后不存在修饰作用，应用受限。④翻译产物的N末端常多余一个甲硫氨酸残基（AUG启始密码子编码）容易引起免疫反应。⑤大肠杆菌产生内毒素给纯化带来不便。⑥蛋白酶水解作用破坏产物。一、宿主菌的选择谢谢你的阅读2019年10月14

1．原核细胞（2）枯草芽孢杆菌

优点：分泌能力强，产物可直接到培养液中。缺点：蛋白酶水解活性更强。

（3）链霉菌优点：①不致病②分泌能力强③具有糖基化能力缺点：培养条件要求高、遗传稳定性差一、宿主菌的选择谢谢你的阅读2019年10月142．真核细胞（1）酵母：无毒、倍增时间短、分泌功能、糖基化作用、使之成为理想的宿主。（2）丝状真菌：肽剪切、糖基化。（3）哺乳动物细胞：产品保真性高，生产效率低。一、宿主菌的选择谢谢你的阅读2019年10月141．载体

表达载体必须具备下列条件：①载体能独立复制②具有多克隆（MCS）位点和标记基因③具有很强的启动子④具有调节基因⑤具有很强的终止子⑥具有产生带有SD序列和AUG的mRNA的能力二、大肠杆菌中的基因表达谢谢你的阅读2019年10月14基因工程药物研究中常用的表达载体（1）PBV220系统①

PL、PR串联启动子，增强启动信号。

②

rrnB基因的终止信号。③

PL、PR与rrnB之间有MCS及SD序列。

④

CITS857抑制子基因（温控诱导）⑤质粒较小（366kb），便于插入大的外源基因二、大肠杆菌中的基因表达谢谢你的阅读2019年10月14PBG-2:

由PBV220衍生,可以表达与IgG结合的融合蛋白，并且是有蛋白剪切位点，便于表达后纯化及纯化后剪切。二、大肠杆菌中的基因表达谢谢你的阅读2019年10月14（2）PET系统①

IPTG诱导（异丙基-硫代-D-半乳糖苷）

②多克隆位点上有NdeI或NCOI单一切点，切开后粘性末端为ATG，便于外源基因插入表达。

③在外源基因的N末端可融合6个His，便于纯化。二、大肠杆菌中的基因表达谢谢你的阅读2019年10月142．影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素（1）外源基因的拷贝数（2）启动子的强弱（3）SD序列的有效性（4）SD与ATG的间距（5）密码子的组成（偏爱性）（6）产物的稳定性（7）产物对宿主的影响二、大肠杆菌中的基因表达谢谢你的阅读2019年10月143．表达形式（1）融合蛋白，增强稳定性。（2）非融合表达。二、大肠杆菌中的基因表达谢谢你的阅读2019年10月14

1．载体

①YEP类（酵母附加体质粒）由大肠杆菌质粒，2μm质粒和Trp或URA3组成，ARS来自2μm质粒。②YRP（酵母复制型质粒）

ARS来自染色体DNA、TrP1、URA3双标及大肠杆菌质粒。

③YCP（酵母着丝粒型质粒）除具有YRP元件外，还具有着粒成份。

三、酵母中的基因表达谢谢你的阅读2019年10月14

④YIP（酵母整合型质粒）含有可与染色体进行同源重组的序列⑤酵母表达型质粒⑥分泌型表达质粒带有控制蛋白质分泌的信号序列三、酵母中的基因表达谢谢你的阅读2019年10月142．影响目的基因在酵母中表达的因素（1）外源基因的拷贝数（2）TATA盒启动子成分（3）分泌信号序列（4）终止序列（5）翻译后修饰（6）对宿主影响三、酵母中的基因表达谢谢你的阅读2019年10月14基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。第四节基因工程菌的不稳定性谢谢你的阅读2019年10月14

1.质粒的分裂不稳定性：指工程菌分裂时出现一定比列不含质粒的子代菌的现象。主要与两个因素有关：（1）含质粒菌产生不含质粒子代的频率，质粒丢失率与宿主菌、质粒特性和培养条件有关。（2）含质粒菌与不含质粒菌比生长速率的差异的大小。

2.质粒的结构不稳定性：指DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。一、质粒不稳定产生的原因：谢谢你的阅读2019年10月14

1.选择合适的宿主菌

2.选择合适的载体

3.选择压力

4.分阶段控制培养

5.控制培养条件

6.固定化二、提高质粒稳定性的方法谢谢你的阅读2019年10月14

一、工程菌选择二、反应器（发酵罐）设计三、发酵培养基组成四、工艺最佳化与参数监测控制第五节基因工程菌中试谢谢你的阅读2019年10月14一、基因工程菌的培养方式二、基因工程菌的培养工艺三、基因工程菌的培养设备第六节重组工程菌的培养谢谢你的阅读2019年10月14基因工程产品纯化前的性质：①目的产物在体系中含量较低②体系中组份复杂（细胞、代谢物、残留培养基及无机盐等）③目的产物稳定性差：对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面活性剂等十分敏感，容易失活、变性。

第七节基因工程药物的分离纯化谢谢你的阅读2019年10月14一、建立分离纯化工艺需了解的各种因素

1.含目的产物的初始物料的特点利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。这些因素包括：（1）菌种类型、形式，各种生物学性质，产物和副产物种类、产物在细胞内所处的位置，表达方式（胞内、胞外、包含体），代谢物种类，产物类似物、毒素和能降解产物的酶类等；（2）原材料和培养基的来源及质量是否稳定；（3）生产工艺和条件。包括灭菌方法和条件，生产方式(连续、批式、半连续)，生产周期，生产能力，工艺控制条件及方式等；（4）初始物料的物理、化学和生物学特性。包括产物浓度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、粘度、流体力学性质和热力学性质等。

谢谢你的阅读2019年10月14一、建立分离纯化工艺需了解的各种因素2.物料中杂质种类和性质物料中杂质种类和性质包括相关性和非相关性杂质的含量、化学性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性(对热、pH、盐、有机溶剂等)、溶解度、分配系数、挥发性及吸附性能等。

谢谢你的阅读2019年10月14二、建立分离纯化工艺需了解的各种因素3.目的产物的特性目的产物特性主要有产物的化学、物理和生物学特性。包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性(对热、冷冻、pH、盐、有机溶剂和金属离子等)、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物活性、亲和性、配基种类、表面活性等。谢谢你的阅读2019年10月14二、建立分离纯化工艺需了解的各种因素

4.产品质量要求

产品质量要求主要包括产品质量指标，产品用途，对纯度、生物活性、比活的要求。允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。谢谢你的阅读2019年10月14二、分离纯化的基本过程

基因工程药物的分离纯化一般包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品、成品加工等步骤。

谢谢你的阅读2019年10月14二、分离纯化的基本过程谢谢你的阅读2019年10月14分离纯化的技术特点：①条件温和②选择性好③收率要高④纯化过程快速谢谢你的阅读2019年10月14三、细胞的破碎方法1.细胞收集

2.细胞破碎

物理破碎法：高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎法、高压挤压法化学破碎法：渗透冲击、增溶法、脂溶法生物破碎法：酶溶法（溶菌酶、甘露糖酶、壳多糖酶等）谢谢你的阅读2019年10月14超声破碎法谢谢你的阅读2019年10月14四、固液分离分离细胞碎片常用的方法有：离心沉淀：高速离心、超速离心膜过滤：微滤、超滤和反渗透双水相萃取：聚乙二醇-葡聚糖聚乙二醇-无机盐谢谢你的阅读2019年10月14五、重组蛋白质的分离纯化

分离纯化主要依赖色谱分离方法。色谱技术包括：离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱等。谢谢你的阅读2019年10月14五、重组蛋白质的分离纯化

1.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

pH、两性分子、侧链、谢谢你的阅读2019年10月14五、重组蛋白质的分离纯化

2.疏水层析：是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法。

疏水层析最常用填料是多聚糖（如琼脂糖）及硅胶。

利用氨基酸侧链的疏水键。

谢谢你的阅读2019年10月14五、重组蛋白质的分离纯化3.亲和层析：是利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。

谢谢你的阅读2019年10月14五、重组蛋白质的分离纯化4.凝胶过滤层析：又称为凝胶排阻层析、分子筛层析，是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。

大分子先从色谱柱中流出谢谢你的阅读2019年10月14六、非蛋白质类杂质的去除1.DNA的去除（1）DNA在pH4.0以上呈阴离子，可用阴离子交换剂吸附除去，但目的蛋白质PI应在6.0以上。（2）如蛋白质为强酸性，则可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而不让DNA吸附上去。（3）利用亲和层析吸附蛋白质，而DNA不被吸附，也可分离。（4）疏水层析对分离也有效，在上柱时需要高盐浓度，使DNA-蛋白质结合物离解，蛋白质吸附在柱上，而DNA不被吸附。谢谢你的阅读2019年10月14六、非蛋白质类杂质的去除2.热原质的去除（1）整个生产过程在无菌条件下进行，防止产生热原质。（2）所有层析介质在使用前先除去热原质，在2~8℃下进行操作，洗脱液需先经无菌处理，流出的蛋白质溶液也应无菌处理，即通过0.2μm微滤膜，并在2~8℃下保存。谢谢你的阅读2019年10月14六、非蛋白质类杂质的去除3.病毒的去除

成品中必须检查是否含有病毒。病毒主要来源于宿主细胞。经过色谱分离，一般能除去病毒，必要时可以用紫外线照射使病毒失活，或过滤将病毒除去。谢谢你的阅读2019年10月14七、选择分离纯化方法的依据根据产物表达形式来选择根据分离单元之间的衔接选择根据分离纯化工艺的要求来选择（1）要具有良好的稳定性和重复性。（2）要尽可能减少组成工艺的步骤。（3）组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺与设备也能相互适应。（4）在工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤，或干扰产品质量。（5）工艺时间要尽可能短。（6）工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备要求低，能耗低。（7）具有较高的安全性。谢谢你的阅读2019年10月14第八节变性蛋白的复性一、包含体形成的原因二、包含体的分离和溶解三、包含体蛋白复性方法谢谢你的阅读2019年10月14一、包含体形成的原因包含体形成的原因主要是高水平表达的结果。在高水平表达时，新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白正确折叠的速率就会导致包含体的形成。重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，也导致包含体的形成。电镜下包含体颗粒谢谢你的阅读2019年10月14一、包含体形成的原因包含体虽然由无活性的蛋白组成，但包含体形成对重组蛋白的生产提供了几个优势：包含体具有高密度，易于分离纯化；重组蛋白以包含体的形式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解；用于生产处于天然构象对宿主细胞有毒害的蛋白。谢谢你的阅读2019年10月14二、包含体的分离和溶解1.包含体的分离（1）对培养收集的重组菌进行破碎（高压匀浆、超声波破碎等），为了提高破碎率，可以加入一定量的溶菌酶。（2）离心除去破碎上清液，沉淀部分用含有低浓度的变性剂（如脲和盐酸胍）、去垢剂（如TritonX-100）、脱氧胆酸钠等化合物的缓冲液进行洗涤，如果需要对包含体进行纯化，一般多采用蔗糖密度梯度离心法。谢谢你的阅读2019年10月14二、包含体的分离和溶解2.包含体的溶解包含体的溶解一般都用强的变性剂如脲、盐酸胍或硫氰酸盐，或去垢剂如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等；对于含有半胱氨酸的蛋白质，还需加入还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇及半胱氨酸。温度一般选择在30℃以促进溶解。此外，由于金属离子具有氧化催化作用，还常常需要加入金属螯合剂如EDTA以除去金属离子。谢谢你的阅读2019年10月14三、包含体蛋白复性方法有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：

①活性蛋白质的回收率高。②正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离。③折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品。④折叠复性方法易于放大。⑤复性过程耗时较少。

谢谢你的阅读2019年10月14第九节基因工程药物的质量控制一、医药生物技术产品质量保证的一般性要点二、生物材料的质量控制三、培养过程的质量控制四、纯化过程的质量控制五、目标产品的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14一、医药生物技术产品质量保证的一般性要点产品安全性评价根据各个具体品种的情况，提出各不相同的安全性评价要求，这类制品安全性临床试验设计方案与试验范围须根据不同情况作不同规定。谢谢你的阅读2019年10月14一、医药生物技术产品质量保证的一般性要点2.产品本身的结构

基因工程产品或人的多肽和蛋白质相同，或其氨基酸序列或翻译后修饰上存在差异，或是非人源性或外源多肽和蛋白质，如病毒、细菌抗原。对上述后两类产品，视其特点作药动学、毒理学研究。对基因修饰产品，要作一般毒性、长期毒性以及致突变、致癌变和致畸变等遗传毒理研究。谢谢你的阅读2019年10月14一、医药生物技术产品质量保证的一般性要点3.严格控制条件宿主细胞中表达的天然基因，转录或翻译后，或精制、工艺放大过程中，都有可能发生变化，故从原料到制成品制备全过程的每一步都须严格控制条件与鉴定质量，确保符合标准规格、安全有效。谢谢你的阅读2019年10月14二、生物材料的质量控制

原材料的质量控制是要确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性，所以原材料的质量控制主要是对目的基因、表达载体以及宿主细胞的检查。谢谢你的阅读2019年10月141.目的基因根据指控要求，需明确目的基因的来源、克隆经过；对于改造过的基因应说明被修改的密码子、被切除的肽段及拼接的方法；使用PCR技术扩增得到的基因，应说明扩增的模板、引物及酶反应条件等情况，并以限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列等分析方法确证基因结构的正确无误。二、生物材料的质量控制谢谢你的阅读2019年10月142.表达载体应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其各组成部分(如复制子、启动子)的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标记物等。二、生物材料的质量控制谢谢你的阅读2019年10月143.宿主细胞应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性等；需阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，是否整合到染色体内及拷贝数，并证明宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中，启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平。二、生物材料的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

在贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过积中，要求质粒稳定，始终无突变；重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。三、培养过程的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

1.生产用细胞库需证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、霉菌和支原体等污染，由原始种子批建生产用工作细胞库。在同一实验室工作区内，不得同时操作两种不同的细胞或菌种，一个工作人员也不得同时操作两种不同的细胞或菌种。建原始种子批须确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。

对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞/载体系统稳定性确定最高允许传种代数。三、培养过程的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

2.培养过程培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；依宿主细胞/载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品。培养周期结束时，应监测宿主细胞/载体系统的特性。三、培养过程的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

分离纯化过程中，常用分级沉淀、超滤、电泳和色谱等技术，其质量控制要求能保证去除微量DNA、糖类、残余宿主蛋白质、纯化过程带入的有害化学物质及热原质，或者将这类杂质都控制在规定限度以下。四、纯化过程的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

纯化工艺的每一步完成后均应测定收获物纯度，计算提纯倍数、收获率等，要对每一步的纯化效率、活性回收率和蛋白回收率进行检测。要明确使用的纯化方法的原理、目的以及预期的去除杂质的效果，在不同纯化步骤中能去除不同性质的杂质，并进行相应的工艺验证。纯化方法的设计应考虑到尽量去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白、糖以及纯化过程带入的其他有害物质。纯化工艺过程中应尽量不加入对人体有害的物质。四、纯化过程的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

如用柱层析技术应提供所用填料的质量认证证明，并证实从柱上不会掉下有害物质。

上样前应清洗除去热原质等。若用亲和层析技术，不应含有可测出的异种免疫球蛋白。如在反相纯化步骤中用到乙腈或甲醇等有机溶剂，用ProteinA亲和层析纯化抗体，有机溶剂和ProteinA等这些对人体有害的物质应加以去除和控制。四、纯化过程的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

基因工程药物质量控制主要包括以下几项要求：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。需要综合利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多门学科的理论与技术，保证基因工程药品的安全有效。五、目的产品的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

1．生物活性测定多肽和蛋白质药物的生物学活性是蛋白质药物的重要质量控制指标。效价测定必须采用国际上通用的方法，测定结果必须用国际或国家标准品进行校正，以国际单位表示或折算成国际标准单位。生物学效价的测定往往需要进行动物体内试验或通过细胞培养进行体外效价测定。体内生物活性的测定要根据目的产物的生物学特性建立适合的生物学模型。体外生物活性测定的方法有细胞培养计数法、3H-TdR掺入法和酶法细胞计数等。五、目的产品的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

蛋白质的比活性是每毫克蛋白质的生物学活性。它不仅是含量指标，也是纯度指标。由于蛋白质的空间结构不能常规测定，而蛋白质空间结构的改变，特别是二硫键的错配，可影响蛋白质的生物学活性，从而影响蛋白质药物的药效，比活性可以间接地反应这一情况。五、目的产品的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

2．理化性质鉴别（1）非特异性鉴别根据还原型电泳的迁移率和高效液相色谱的保留时间和峰型来

进行分析。（2）特异性鉴别利用免疫印迹、免疫电泳、免疫扩散等免疫学方法，确定蛋白

质的抗原性。五、目的产品的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

（3）相对分子质量测定蛋白质相对分子质量测定最常用的方法有凝胶过滤法和SDS法，凝胶过滤法测定完整的蛋白质相对分子质量，而SDS法测定蛋白质亚基的相对分子质量。（4）等电点测定样品用等点聚焦法测定等电点。在生产过程中，批与批之间的电泳结果应该一致，以此控制生产工艺的稳定性。五、目的产品的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

（5）肽图分析肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进行分离分析。是一种检测蛋白质一级结构中细微变化的最有效方法。肽图分析可作为制品与标准品作精密比较的手段，与氨基酸成分和序列分析结果合并，作为蛋白质的精确鉴别。该技术灵敏高效，是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。同种产品不同批次的肽图的一致性是工艺稳定性的验证指标。五、目的产品的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

蛋白质降解形成的肽段的鉴定可以用SDS电泳法、高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography,HPLC）、毛细管电泳法及质谱法来测定。五、目的产品的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

（6）氨基酸组成分析一般对含50个左右的氨基酸残基的蛋白质的定量分析接近理论值。完整的氨基酸成分分析结果，应包括甲硫氨酸、胱氨酸和色氨酸的准确值。氨基酸成分分析结果应为三次分别水解样品测定后的平均值。测定的重组蛋白质的氨基酸组成应与标准品一致。氨基酸组成分析采用氨基酸自动分析仪测定，包括蛋白质水解、自动进样，氨基酸分析、定量分析报告等内容。五、目的产品的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

（7）部分氨基酸序列分析此项是重组蛋白质的重要鉴别指标，一般要求对中试前

三批产品至少应该测定N端15个氨基酸，C端应根据情况测定1~3个氨基酸。（8）蛋白质二硫键分析测定巯基的方法有别PMCB法、DTNB法、NEMI法等。五、目的产品的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

3.蛋白质含量测定主要用于原液比活性计算和成品规格的控制。蛋白质含量可根据其物化性质采用Folin-酚试剂法、染色法（Bradford）、双缩脲法、紫外吸收法，HPLC法和凯氏定氮法等方法，其中Folin-酚试剂法、染色法是在质量检定中常使用的方法。五、目的产品的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

4.蛋白质纯度分析纯度分析是基因工程药物质量控制的关键项目。测定蛋白质含量可根据其本身理化性质和生物学特性设计。通常采用的方法有还原性及非还原性SDS、等电点聚焦、各种HPLC及毛细管电泳等。五、目的产品的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

5.杂质的检测基因工程产物的杂质包括蛋白质和非蛋白质两类。五、目的产品的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

（1）蛋白类杂质

在蛋白类杂质中，最主要的是纯化过程中残余的宿主细胞蛋白。测定采用免疫分析的方法。同时需辅以电泳等其他检测手段补充和验证。除宿主细胞蛋白外，目的蛋白本身也可能发生某些变化，形成在理化性质上与原蛋白质极为相似的蛋白杂质，在体内往往会导致抗体的产生，在质量控制中也要加以严格控制。五、目的产品的质量控制谢谢你的阅读2019年10月14

（2）非蛋白类杂质具有生物学作用的非蛋白类杂质主要有病毒和细菌等微生物、热原质、内毒素、致敏原及DNA。基因工程药物应证实最终制品