实验大肠菌群的检验

实验大肠菌群的检验第一页，共二十八页，编辑于2023年，星期二实验目的掌握鉴别大肠菌群的方法。掌握以最大概率数法测定大肠菌群数量的方法。第二页，共二十八页，编辑于2023年，星期二实验原理

大肠菌群指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品有否被肠道致病菌污染。食品中大肠菌群以100ml检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。第三页，共二十八页，编辑于2023年，星期二第四页，共二十八页，编辑于2023年，星期二实验设备恒温培养箱：（36±1）℃显微镜培养皿

试管、移液管、三角烧瓶、小倒管天平载玻片第五页，共二十八页，编辑于2023年，星期二实验试剂乳糖胆盐发酵管：20g蛋白胨、5g猪胆盐及10g乳糖溶于1L水中，校正pH为7.4，加25ml溴甲酚紫指示液(0.4g/L)，分装每管20ml,

并放入一个小倒管，115℃高压灭菌20

min。伊红美蓝琼脂平板：10g蛋白陈、2gK2HPO4及17g琼脂溶解于1L水中，校正pH至7.1，分装于锥形瓶内，121℃高压灭菌15min。临用时加人10g乳糖并加热溶化琼脂，冷至50～55℃。加人20mL伊红溶液（20g/L)和10ML美蓝溶液（6.5g/L）摇匀，倾注平板。第六页，共二十八页，编辑于2023年，星期二乳糖发酵管：

将20g蛋白陈和10g乳糖溶于1L水中，校正pH至7.4，加入25mL溴甲酚紫指示液(0.4g/L)，按检验要求分装，并放人一个小倒管，加热至115℃高压灭菌15min灭菌生理盐水：0.9％第七页，共二十八页，编辑于2023年，星期二革兰氏染色液：

①结晶紫染色液：1g结晶紫溶于20mL95%乙醇，与80mL草酸铵溶液（10g/L)混合，摇匀。②革兰氏碘液：1g碘与2g碘化钾混合后，用少量水溶解，稀释至300mL。③沙黄复染液：0.25g沙黄溶于10ml95%乙醇中，然后用90ml水稀释，混匀。第八页，共二十八页，编辑于2023年，星期二实验内容与步骤1）检样稀释（无菌操作）①将25mL（或g）检样置于含225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶，充分振摇（固体检样用匀浆器，用8000－10000r/min的速度处理1min）制成1：10的均匀稀释液。②用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，混匀，制成1：100的稀释液。③另取1mL灭菌试管，按②操作依次做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1mL灭菌试管。第九页，共二十八页，编辑于2023年，星期二2）乳糖发酵实验接种2mL待检样品于乳糖胆盐发酵管内。接种3个稀释度，每一稀释度接种3管，置（36土1)℃温箱内培养（24士2)h。如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠杆菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。第十页，共二十八页，编辑于2023年，星期二3）分离培养将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝琼脂平板上，置（36士1)℃恒温箱内培养18一24h。取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。第十一页，共二十八页，编辑于2023年，星期二4）证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1一2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（36士1)℃恒温箱内培养（24士2)h，观察产气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏染色为阴性的无芽袍杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。第十二页，共二十八页，编辑于2023年，星期二实验报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（或g）大肠菌群的MPN。第十三页，共二十八页，编辑于2023年，星期二第十四页，共二十八页，编辑于2023年，星期二第十五页，共二十八页，编辑于2023年，星期二第十六页，共二十八页，编辑于2023年，星期二第十七页，共二十八页，编辑于2023年，星期二注：①本表采用3个稀释度：1ML(g)，0.1mL(g）和0.01mL(g)。每稀释度3管。②表内所列检样量如改用10mL(g)，1mL(g）和0.1mL(g）时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.1ML(g),0.01ML(g）和0.001mL(g）时，则表内数字应相应增加10倍，其余可类推。第十八页，共二十八页，编辑于2023年，星期二1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法附1：平板划线接种方法第十九页，共二十八页，编辑于2023年，星期二第二十页，共二十八页，编辑于2023年，星期二第二十一页，共二十八页，编辑于2023年，星期二第二十二页，共二十八页，编辑于2023年，星期二附2：革兰氏染色法操作步骤1、涂片：取大肠杆菌制成涂片，干燥，固定。2、染色：用草酸铵结晶紫染色1min,用水冲洗。3、媒染：滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖1min，用水冲去碘液。4、乙醇脱色：斜置载玻片于一烧杯上，滴加95%乙醇，并轻轻摇动载片，至乙醇液不呈现紫色时停止（约0.5min）。立即用水冲净乙醇并用滤纸轻轻吸干。脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。第二十三页，共二十八页，编辑于2023年，星期二5、复染：蕃红染液复染1min,水洗。6、吸干并镜检：若研究工作中要确证未知菌的革兰氏反应时，则需同时用已知菌进行染色作对照。第二十四页，共二十八页，编辑于2023年，星期二步骤：结果:

阳性菌——紫色阴性菌——红色结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色蕃红复染涂片固定革兰氏染色法（GramStain）第二十五页，共二十八页，编辑于2023年，星期二细菌经结晶紫初染染成紫色。

革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为紫色。

革兰氏染色阴性菌（G-）细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经蕃红复染成红色。第二十六页，共二十八页，编辑于