药物分析 第17章 生物药物分析概论

第十七章生物药物分析概论

化学药物生物药物中药

药品

第一节概述一、生物药物生物药物（BiopharmaceuticalDrugs）是利用生物体、生物组织或其成分，综合应用物理学、化学、生物化学、微生物学、免疫学和药学原理与方法制得的各种天然活性物质及其人工合成或半合成的物质。生物药物按来源和生产方法分为：

生化药物、生物制品和其他相关生物医药产品。二、生物药物分析的特点1.相对分子质量的测定

生物药物除氨基酸、核苷酸等为小分子化合物，其他如蛋白质、多糖、核酸均为大分子的生命物质，相对分子量大，不是定值。即使组分相同，往往由于分子量不同而产生不同的生理活性（如肝素），故要进行相对分子质量的测定。2.生化法确证结构常需要选择生物化学分析如氨基酸组成、N端氨基酸序列、肽图等方法加以证实。如重组人干扰素α1b：

除理化分析外，按规定进行肽图检查，至少每年测定一次产品N端氨基酸序列。3.生物活性检查

质量不稳定，特别是制备多肽或蛋白质类药物时，因生产工艺条件的变化，导致失活。故需要进行生物活性的检查。如重组人干扰素α2a的原液检定要进行生物学活性的检查。4.安全性检查

此类药物性质特殊，生产工艺复杂，易引入生理活性杂质，故需要进行安全性的检查。如重组人干扰素α2a原液中要检查外源性DNA残留量，鼠IgG残留量，宿主菌蛋白残留量、残余抗生素活性。5.需做效价（含量）测定第二节生化药物分析

生化药物是从生物体分离纯化或用化学合成、微生物合成或现代生物技术制得的生化基本物质。特点：1.是生物体内的基本生化成分2.来自生物体，来源复杂，有些结构不明确，相对分子量不是定值，多属于高分子物质。一、生化药物的种类（一）氨基酸及其衍生物

各种单氨基酸、氨基酸衍生物和复合氨基酸。（二）多肽与药用蛋白多肽：脑多肽、激肽、催产素等药用蛋白：牛纤维蛋白原、水蛭素、生长素、催乳素、天花粉蛋白等（三）酶类与辅酶类药物

辅酶Q10、蛋白水解酶、凝血酶等（四）多糖类药物肝素、硫酸软骨素A和C、灵芝多糖、透明质酸、黄芪多糖、人参多糖等（五）脂质类药物

亚油酸、卵磷脂、胆固醇、胆红素等（六）核酸及其降解物和衍生物类药物ATP、5-氟尿嘧啶、肌苷等（七）多组分生化药物二、生化药物的鉴别（一）理化鉴别法理化鉴别法包括化学鉴别法、光谱鉴别法和色谱鉴别法。谷氨酸片【鉴别】取本品的细粉适量（约相当于谷氨酸5mg），加水5ml，加热使谷氨酸溶解，滤过，取滤液，加茚三酮约5mg，加热，溶液显蓝至紫蓝色。门冬酰胺【鉴别】

（1）取本品约1g，加10%氢氧化钠溶液5ml，微热至沸，产生的蒸汽能使湿润的红色石蕊试纸变蓝色，并有氨臭。（2）取本品约1mg，加水5ml溶解后，加茚三酮约5mg，加热，溶液显紫色。细胞色素C溶液【鉴别】取含铁量项下的供试品溶液lml，置50ml量瓶中，用磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠1.38g与磷酸氢二钠31.2g，加水适量使溶解成1000ml,调节pH值至7.3）稀释至刻度，加连二亚硫酸钠约15mg,摇匀，照紫外-可见分光光度法（通则0401）测定，在520nm与550nm的波长处有最大吸收，在535nm的波长处有最小吸收。胰岛素【鉴别】在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。1.酶法高效、专一的催化某些生化反应。如尿激酶的鉴别。（二）生化鉴别法尿激酶【鉴别】取效价测定项下的供试品溶液，用巴比妥-氯化钠缓冲液（pH7.8）稀释成每1ml中含20单位的溶液，吸取1ml，加牛纤维蛋白原溶液0.3ml，再依次加人牛纤维蛋白溶酶原溶液0.2ml与牛凝血酶溶液0.2ml，迅速摇匀，立即置37℃±0.5℃恒温水浴中保温，立即记时。应在30~45秒内凝结,且凝块在15分钟内重新溶解。以0.9%氯化钠溶液作空白，同法操作，凝块在2小时内不溶（试剂的配制同效价测定）。2.电泳法ChP采用琼脂糖凝胶电泳法鉴别肝素钠乳膏：取本品适量（约相当于肝素钠700单位），加60%乙醇溶液10ml，水浴加热使溶解，于4℃的冰箱中放置约5小时，取出，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取肝素钠标准品，加水溶解并制成每1ml中含200单位的标准品溶液。取标准品溶液与供试品溶液各2l，照电泳法（通则0541第三法）试验，供试品溶液与对照品溶液所显斑点的迁移距离的比值应为0.9～1.1。（三）生物鉴别法利用生物体对药物的反应来鉴别药物。鉴别通常需要标准品或对照品在同一实验条件下进行对照试验加以确证。

如玻璃酸酶的鉴别。（降血糖）葡萄糖惊厥停止利用小鼠的惊厥反应来鉴别胰岛素：胰岛素取本品适量，加用酸调节至pH值为2.5～3.0的水制成每1ml中含5单位的溶液。在20~30℃条件下，取体重为20~24g的小鼠5只，按每20g体重皮下注射上述溶液0.25ml，注射2小时后，至少应有4只小鼠发生惊厥。立即给惊厥的小鼠腹腔注射10％葡萄糖液1ml，应能使惊厥停止。（四）肽图检查法肽图检查法是通过蛋白酶或化学物质裂解蛋白质后，采用适宜的分析方法鉴定蛋白质一级结构的完整性和准确性。ChP通则3405肽图检查法共收载二法，第一法为胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法，第二法为溴化氰裂解-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。胰岛素的鉴别ChP取本品适量，用0.1%三氟醋酸溶液制成每1ml中含10mg的溶液，取20µl，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（pH7.3）20µl、0.1%V8酶溶液20µl与水140µl，混匀，置37℃水浴中2小时后，加磷酸3µl，作为供试品溶液；另取猪胰岛素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。照含量测定项下的色谱条件，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液（pH2.3）-乙腈（90∶10）为流动相A，乙腈-水（50∶50）为流动相B，按下表进行梯度洗脱。取对照品溶液和供试品溶液各25µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液的肽图谱应与对照品溶液的肽图谱一致。

生化制药主要有六个阶段：（1）原料的选择和预处理；（2）组织及细胞的破碎；（3）从破碎的细胞中提取有效成分制成粗品；（4）采用多种生化技术从粗品中将目的物精制出来；（5）干燥及保存；（6）制剂。三、生化药物的检查（一）杂质检查1.氨基酸类药物中其他氨基酸的检查

2.多肽类药物中特殊杂质的检查3.蛋白类药物中有关蛋白的检查4.酶类药物中其他酶的检查5.多糖类药物中特殊杂质的检查（二）安全性检查1.热原与细菌内毒素检查法细菌内毒素：鲎试剂法热原：家兔法3.过敏反应检查

检查药物中的异性蛋白。

试验动物：豚鼠2.异常毒性检查法

试验动物：小鼠4.降压物质检查法

检查药物中可能导致血压降低的杂质。

检查方法：猫血压法5.无菌检查（一）理化分析法四、生化药物的含量测定1.容量分析法盐酸组氨酸缩合后酸碱滴定法取本品0.2g，精密称定，加水5ml溶解后，加甲醛与乙醇的中性混合溶液，加酚酞指示液数滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。每1ml氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于10.48mg的C6H9N3O2·HCl·H2O。2.紫外-可见分光光度法五肽胃泌素分子结构中具有较多羰酰基和酰胺基，在280nm波长处有最大吸收，ChP采用UV法测定含量，吸收系数法定量。3.HPLC法具有温和的分析条件与良好的生物兼容性，有利于保持生物大分子的构象和生理活性，广泛用于生化药物的含量测定。（1）反相高效液相色谱法（2）离子交换色谱法（3）分子排阻色潽法酶能专一、高效地催化某化学反应，通过测定酶反应速度或生成物浓度而检测供试品含量。（二）酶分析法1.酶活力测定法

以酶为分析对象。酶活力：指酶催化化学反应的能力，即测定被酶催化的化学反应的速率。单位时间内底物减少或产物增加酶活力单位：酶在25ºC下，以最合适的底物浓度、缓冲液离子强度和pH条件下，每分钟能转化1mol底物的酶量为一个活性单位。比活性：2.酶法分析

以酶为分析试剂或工具。（三）生物检定法生物检定法是利用生物体包括整体动物、离体组织、器官、细胞和微生物评价药物生物活性的一种方法。它以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计在一定条件下比较供试品和相应的标准品或对照品所产生的特定反应，通过等反应剂量间比例的运算或限值剂量引起的生物反应程度，从而测定供试品的效价、生物活性或杂质引起的毒性。第三节生物制品分析生物制品：以微生物、细胞及各种动物和人源组织和体液等为原料，运用传统技术或现代生物技术制成，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。收载于ChP2015三部。一、生物制品的种类（一）疫苗类药物

细菌类疫苗（如狂犬病疫苗）、病毒类疫苗（如乙肝疫苗）、联合疫苗（如百白破疫苗）、双价及多价疫苗（双价肾综合征出血热灭活疫苗）。（二）抗毒素及抗血清类药物

凡用细菌类毒素或毒素免疫马或其他大动物所取得的免疫血清叫抗毒素或抗血清。如破伤风抗毒素等。凡用细菌或病毒本身免疫马或其他大动物所取得的免疫血清叫抗菌或抗病毒血清，如抗蝮蛇毒血清等。

这类药物中含有大量抗体，注入体内不需自身制造抗体就可以获得免疫力。只能作为应急措施，排泄时间快，预防时间短。

（三）血液制品

由健康人血浆或经特异免疫的人血浆，经分离、提纯或由DNA重组技术制成的血浆蛋白组分，以及血液细胞有形成分统称为血液制品。如人血白蛋白、人凝血因子等。（四）重组DNA制品

采用遗传修饰，将所需制品的编码DNA通过一种质粒或病毒载体，引入适宜的微生物或细胞系，DNA经过表达和翻译后成为蛋白质，再进行提取和纯化而回收所需制品制得。如重组人表皮生长因子。（五）微生态活菌制品如双歧杆菌乳杆菌三联活菌片（六）诊断制品如乙肝病毒表面抗原诊断试剂盒

二、生物制品质量控制的特点生物制品质量控制的特点是是针对生产全过程的质量控制。

生物制品的质量需要从原材料、生产过程到最终产品进行全过程控制，对原液、半成品和成品进行微生物学、化学和物理学检定。

原液（bulk）是指用于制造最终配制物或半成品的均一物质，由一次或多次单次收获物而得到，一般需要纯化并可能配制一批或多批半成品。原材料的质量控制包括疫苗菌种库或细胞库、种子批系统、生产用培养基、外源因子和原料血浆。生产过程的控制包括生产培养物的检定和原液检定，原液检定项目主要有细菌/细胞纯度检查、安全性检查和浓度测定。半成品检定包括稳定剂检测、无菌试验、活性或病毒含量。最终产品的质量控制要根据纯化工艺过程，产品理化性质、生物学性质、用途等来确定质量控制项目，一般要从物理化学性质、生物学活性(比活性)、纯度、杂质检测、安全试验方面进行检定。三、物理化学检定1.鉴别理化方法（HPLC、UV）

生物学方法：免疫印迹法、免疫斑点法、免疫双扩散法、酶联免疫法2.物理性状检查3.相对分子量的测定

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法4.蛋白质纯度分析

HPLC法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法5.等电点等电聚焦电泳，毛细管电泳（反映生产工艺的稳定性）6.氨基酸序列分析

Edman化学降解法（重组蛋白质和多肽重要的鉴别方法）组成蛋白质的基本单位是氨基酸，氨基酸通过脱水缩合形成肽链，蛋白质是一条或多条多肽链组成的生物大分子。不同品种应针对自身蛋白质特性选择适宜的测定方法并做相应方法学验证，同时应尽可能选用与待测定品种蛋白质结构相同或相近的蛋白质作对照品。7.蛋白质含量测定法

ChP2015通则0731第一法凯氏定氮法：本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物，当与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化时使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根据酸的消耗量算出含氮量，再将含氮量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。第二法福林酚法（Lowry法）本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu2+螯合形成蛋白质-铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

第三法双缩脲法本法系依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中Cu2+形成紫红色络合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的