药物分析 第05章 体内药物分析

第五章

体内药物分析1.取样2.鉴别3.检查4.含量测定5.检验报告工作程序

药品检验工作的基本内容完整的生物样品分析过程样品分析过程时间分配示意图样品采集样品前处理分析测定数据处理报告结果常用体内样品的制备与贮藏

1体内样品分析的前处理

2体内样品分析方法与方法验证

3体内药物分析定义体内药物分析是指体内样品（生物体液、器官或组织）中药物及其代谢或内源性生物活性物质的定量分析。体内药物分析的定义体内样品（生物体液、器官或组织）中药物及其代谢产物或内源性生物活性物质的定性、定量分析。体内样品——确定分析对象药物、代谢产物、内源性生物活性物质——确定待分析物定性、定量分析——如何选择分析手段、建立方法并验证体内·药物·分析原料药纯度高

干扰少容量分析为主制剂主药一或多

辅料干扰多仪器分析为主体内药物成分复杂

干扰众多

浓度很低高灵敏度

高选择性的方法分析意义与体内药代动力学研究和临床治疗药物监测密切相关，直接关系到药物的体内作用机制探讨与质量评价和药物临床使用的安全、有效与合理。分析样品种类血液尿液唾液头发脏器组织其它特殊样品?

体内样品的种类体液组织排泄物血液;唾液;脑脊液;胃液;胆汁;乳汁;精液;泪液尿液粪便;汗液胃;肠;肝;肾;肺,脑;肌肉;头发分析目标药物在体内的某些代谢产物常具有一定的生理活性,它们在体内的变化规律对母体药物的药理学与毒理学评价特别重要.机体内源性生物活性物质往往参与机体重要的生理过程,其变化规律的异常改变也与某些疾病的发病机制密切相关母药药物特有代谢产物体内内源性生物活性物质第五章体内药物分析分析对象人动物鼠兔犬大鼠小鼠男女等等猴猩猩都是一些志愿者也有一些不知情的人须动物管理与使用委员会同意分析对象药物在体内的形态游离型代谢产物游离型原药结合型原药结合型代谢产物情形极为复杂缀合物分子间力结合化学共价结合称为两类体内药物分析对象和待测物特点★成分复杂、干扰众多生物基质的干扰——蛋白质、糖、脂肪、离子……其他药物的干扰——卡马西平治疗癫痫的有效血药浓度为3~8μg/ml，潜在中毒浓度为12μg/ml。病人可能之前用过其他抗癫痫药物如丙戊酸钠、乙琥胺等。代谢产物与原型药物互相干扰——抗抑郁药米氮平方法选择性要高体内药物分析对象和待测物特点★采样量小，浓度很低常见的生物样品采样量少，特定条件采集，不易重新获得

血浆：人1~3ml；犬1~5ml；大鼠0.3~0.5ml浓度为ng/ml~µg/ml数量级血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、胆汁、乳汁、脑脊液等均匀生物样品心、肝、脾、肺、肾、脑等非均匀生物样品方法灵敏度要高体内药物分析方法的特点★对分析方法的要求高：满足灵敏度及专属性的要求样品需要经过前处理，才能分析分析工作量大，方法验证要求严格，测试数据处理和结果阐明较为复杂1.概述体内样品分析方法色谱及其联用方法免疫学方法生物学微生物学方法HPLC,GC,HPLC-MS,HPLC-MS/MS,GC-MS,GC-MS/MS放射（RIA）荧光（FIA）酶（EIA）适合小分子及代谢物，蛋白质大分子药物等生物大分子药物分析抗生素分析体内药物分析的任务定性分析——药物代谢产物、内源性物质是什么定量分析——血浆、组织、尿液药物及代谢物浓度药物代谢与动力学（drugmetabolismandpharmacokinetics，DMPK）研究——新药研发治疗药物监测（TherapeuticDrugMonitoring，TDM）——临床应用内源性物质检测——疾病标志物社会事件中的分析——食品安全、法医毒物分析等1.概述体内药物分析的任务：DMPK药代动力学研究涉及药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄等动态过程，需要研究血药/组织浓度－时间曲线的变化，探讨药物分布与药理作用的关系。药物代谢与动力学血药浓度-时间曲线尿药累积排泄曲线生物等效性评价绝对生物利用度相对生物利用度代谢途径代谢酶……体内药物分析的任务：TDMTDM即测定血液中或其它体液中药物浓度，观察临床药物反应，考察药物治疗效果，必要时根据药动学原理调整给药方案。方向是实现个体化给药，目的为临床合理用药服务，达到最佳的药物治疗效果。治疗范围中毒范围无效范围C最大耐受浓度最小有效浓度治疗药物监测血药浓度μg/ml10~2020~3030~40>40药理及

毒性反应有效血药浓度眼球震颤运动失调精神异常抗癫痫药苯妥英钠血药浓度与药理作用及毒性反应患者女性，25岁，因癫痫强直阵挛性发作入院，遂静脉注射负荷剂量苯妥英钠800mg并开始口服维持剂量250mg/d。测得苯妥英钠的浓度为3.6μg/ml，医生考虑到尚未达到治疗浓度范围，故增加剂量到400mg/d。患者出现痉挛等类似癫痫发作症状。测得血药浓度为10.9μg/ml，医生拟打算再次增加剂量。患者白蛋白为20g/L(正常范围是34~48g/L)，于是建议检查患者游离苯妥英钠浓度。结果显示游离苯妥英钠浓度为4.9μg/ml（游离药物治疗浓度范围1~2μg/ml），判定患者苯妥英钠中毒，建议降低剂量为250mg/d。体内药物分析的任务：内源性物质检测体内内源性物质如氨基酸、激素、儿茶酚胺、肌酐、草酸、尿酸等。机体正常生理条件或机体发生病变：测定体内内源性物质或疾病标志物的含量，疾病的辅助诊断或及早预防。药物（中药）代谢组学研究体内药物分析的中心任务体内药物分析方法学研究生物样品预处理方法分离分析实验条件的优化选择考察体内分析方法的灵敏度、专属性、准确度、线性范围等为临床药理学、临床药学等相关学科提供专一、灵敏、准确、快速、简便的体内药物分析方法。第一节常用体内样品的制备与贮藏常用样品的种类:(一)血样:药物在体内主要依靠血液运输,血药浓度可作为药物在作用部位浓度的指标.

①血浆(plasma)

②血清(serum)③全血(二)唾液:很少采用(三)尿液:用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度，药物代谢物及其代谢途径、类型、速率等的研究；临床上用于判断患者是否违反医嘱用药。其它：头发、组织、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便。常用样品的种类采集方法1、血液（blood）——血浆、血清和全血——体现药物浓度和治疗作用之间的关系。

——最常用的生物样本。

（1）血样的采集：注射器、毛细管眼眶采血、静脉插管手术、滞留针股静脉取血

动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一。（2）血样的制备：

测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血。①

血浆（plasma）的制备静脉血2500~3000r/min离心5~10min血浆置含抗凝剂试管中抗凝剂：

肝素（最常用）、EDTA、椐橼酸盐、草酸钙、氟化钠。②

血清（serum）的制备静脉血2500~3000r/min离心5~10min置无抗凝剂试管中37ºCor室温放置30~60min拨去血饼血清

血浆比血清的分离快，而且制取的量约为全血的50%~60%，血清只为全血的20%~40%，多数研究者用血浆进行分析测定。③全血（wholeblood）的制备静脉血置含抗凝剂试管中保持血浆和血细胞的匀相状态全血

血样主要用于药物动力学、生物利用度等研究及临床治疗药物浓度监测。——最常用的生物样本。体内样品种类与采集血液自然凝结加抗凝剂离心离心全血上层：血清serum（比血浆少纤维蛋白原）（40%）下层：血细胞（凝块）上层：血浆

plasma（50%）下层：血细胞血样Blood一般在给药后的不同时间点采集血样血清比血浆只是少一种纤维蛋白原

C血浆=C血清血浆比血清的分离快，而且制取量约为全血的50%~60%（血清为全血的20%~40%），多数用血浆进行分析。若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品

血浆与血清的区别总结血液=血浆+血细胞血浆=血清+纤维蛋白原+凝血因子血细胞=白细胞+红细胞+血小板

血液：流动在心脏和血管内的不透明红色液体。主要成分为血浆、血细胞血浆：血浆是血液的重要组成部分，呈淡黄色液体血清：血清，指血液凝固后，在血浆中除去“纤维蛋白”而得到的淡黄色透明液体2、唾液（saliva）--腮下腺-舌下腺--颌下腺

一些药物的唾液药浓(S）与血浆游离药浓（P）密切相关，因此：——TDM中利用对S的测定代替对P的监测——药代动力学的研究采集方法苯妥英钠的Cs/Cp比值恒定（1）唾样的采集：

在潄口后15min，安静状态下采集口腔内自然流出的唾液；也可在刺激下快速采样(需注意干扰)。物理法(口嚼石腊片、聚四氟乙烯块或纱布球等)化学法(将柠檬酸或维生素C等置于舌尖)弃去初始部分后采集刺激法的优点——缩短采样时间——减小唾液pH波动（pH≈7.0）——S/P的个体差异小（2）唾样的制备——唾样采集后，立即测量其除去泡沫部分的体积，以3000rpm离心10min，取上清液直接测定或冷冻保存。采集方法1:尿液特点量大；非创伤性；尿液中药浓度较高。2:尿液缺点食物饮；水影响；排汗。3:尿液性质淡黄色；成人日量1-5L；pH4.8-8.0；加防腐剂贮存。4:采集方法采集24h尿液：8时排尿弃去，立即服药，尿液收集容器中，次日8时最后一次收集；分段收集5:肾功影响药物的排泄

尿药浓度与血药浓度相关性差；有些难收集（如小孩）。尿液动物试验中用代谢笼收集尿、粪，只能以时间段采集，有时会有收集不到的情况。尿药浓度变化大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。尿样测定多用于药物排泄、生物转化研究。2023/6/1441优点容易获得，属非损伤性取样，且样品量大；尿中药物浓度高，含有缀合物或代谢物，是研究代谢物结构的首选样品；蛋白含量极低，不需去蛋白处理。

缺点与血药浓度不相关，难以反映药物作用过程；受肾功能、pH影响；难以定时定量取样，易污染；所含成分复杂，已知其中有紫外吸收的化合物就达数十种。2023/6/1442组织采集：先取各种组织，应用匀浆器均匀化制成水性基质匀浆液，再以适当方法萃取。组织样品要经过蛋白沉淀：甲醇、乙腈、高氯酸、三氯乙酸沉淀。酸、碱水解：将组织水解掉酶水解：应用酶将组织水解掉其它：头发等组织样品药物在组织中的分布提供重要的体内动力学过程组织常用提取方法：（1）匀浆化法（简单，回收率低）（2）沉淀蛋白法（简单，回收率低）（3）酸水解或碱水解（适合于酸碱条件下稳定的药物或毒物）（4）酶水解法（避免高温降解，不适合碱性条件下水解的药物或毒物）2023/6/1444实例：以下可采取哪种样品提取方法：1）利多卡因在肝脏中的组织分布？2）阿司匹林在心脏中的组织分布体内样品贮存与处理冷藏与冷冻去活性-20℃到-80℃,低温终止酶的活性其它方式去除酶的活性，防止样品进一步代谢分解样本量大，分析时间长，要保证药物不变质，须贮存与处理1．血样（血浆、血清）及时分离→冷藏，-70℃加入稳定剂NaF2．尿样

①尿中水、无机盐、尿素等细菌的生长，4℃保存

②加入防腐剂a．1%甲苯b．饱和氯仿c．pH改变3．唾液：同血样冷冻与冷藏去活性去活性：为防止酶进一步分解体内待测组分，采样后必须终止酶的活性。常用方法有“液氮快速冷冻法、微波照射法、匀浆及溶淀，加酶活性阻断剂、抗氧化剂、样品煮沸等。第二节、体内样品的前处理体内样品的前处理是体内药物分析中极为重要的环节,也是分析中最困难、最繁复的工作。请先看如下处理步骤与方法全血/血浆，组织(1)蛋白沉淀(2)调节pH选择性溶剂提取RIA残渣化学衍生化(提取烃基化)碱回提酸回提HPLCUV、FLD、ECDTLC分光光度法UV、FLDGCFIDECDN/P-FIDGC-MS处理步骤与方法预处理的目的使待测药物游离满足测定方法要求改善分析环境药物进入体内后有多种存在形式，进行预处理使之游离出来，便于测定药物或代谢药物的总浓度体内样品介质组成复杂，干扰很多，而待测药物组分浓度很低，进行预处理可以分离浓集样品。防止仪器的污染、劣化，提高测定的灵敏度和选择性。不同的仪器及分析方法对样品有不同的要求，须处理。常用体内样品预处理方法去除蛋白质方法分离与富集方法微透析技术缀合物水解化学衍生化萃取如何进行？蛋白质的去除加入与水混融的有机溶剂(乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃)加入中性盐(饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐)加入强酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸)加入金属沉淀剂(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)缀合物的水解酸水解(盐酸)酶水解(葡糖酸苷酶、硫酸酯酶、枯草菌溶素)有机破坏

(硝酸-高氯酸消化)分离、纯化与浓集液-液萃取法

(Liquid-LiquidExtraction,LLE)液-固萃取法

(Liquid-SolidExtraction,LSE)溶解剂法(硝酸-高氯酸消化)常用体内样品预处理方法去除蛋白质方法加入与水混融（亲水性）的有机溶剂（乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃）。溶液的介电常数下降，蛋白质分子间静电力增加而聚集；亲水性溶剂使蛋白质水化膜脱落而析出沉降，并使与蛋白质以氢键及其它分子间作用力结合的药物析释放出来。

溶剂沉淀法混比1：2~3，

冷冻离心蛋白沉淀过程示意图A B C DA血浆样品200µlB加入甲醇600µlC涡旋混合3min后D10000rpm离心10min后56沉淀剂每1容积血浆加入沉淀剂容积0.21.02.03.04.0甲醇17.673.498.798.999.2乙腈13.497.299.799.899.810%三氯醋酸99.799.599.899.899.8钨酸盐-硫酸3.399.799.899.9100.0(饱和)硫酸铵21.353.498.3**CuSO4-Na2WO436.597.599.9100.0100.0ZnSO4-NaOH41.194.299.398.899.6常用蛋白沉淀剂的用量及沉淀蛋白的百分率*：样品浑浊，妨碍准确测定去除蛋白质方法混比1：2，

冷冻离心加入中性盐(饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐)，使溶液的离子强度发生变化，部分蛋白质的电性被中和，蛋白质的分子间排斥力减弱而凝聚；同时中性盐使蛋白质水化膜脱落而析出沉降。中性盐析法去除蛋白质方法混比1：0.6，

冷冻离心加入强酸(10%三氯醋酸、6%高氯酸等)，影响蛋白质等电点及开成不溶性盐而沉降。强酸沉降法去除蛋白质方法热变性蛋白质离心煮鸡蛋？热凝固法（1）优点：①与杂质分离②简便③浓集④提取率高（2）提取率：在有机相与水相中的溶解度的比值分配系数，一般少量多次，对生物样品一般一次萃取，>70%重现性分离与浓集液液萃取LLE利用药物在有机溶剂中的溶解度大于在水中的溶解度而提取（3）影响提取率的因素①pH：碱性药物在碱性pH，酸性在酸性pH②提取溶剂相似相溶原理沸点低，不影响检测,性质稳定，不起化学反应(化学惰性）③离子强度加入中性盐增加离子强度，与水结合强，便于有机溶剂提取分离与浓集对于离子性特强，水溶性极大的药物，可采用离子对提取①原理：在体液(水溶液)中呈离解状态的酸性或碱性有机药物(Q)，与呈相反电荷离子(X)作用形成具有一定脂溶性的离子对(QX)，再用有机溶剂提取②应用测定碱性药物——用烷基磺酸盐

（RSO3-）作为反离子

如戊~辛烷磺酸钠、月桂磺酸钠等测定酸性药物——用烷基季铵类化合物

（R4N+·X-）作为反离子

如氢氧化四乙基铵、四丁基铵、四辛基铵等分离与浓集液液萃取示意图取1ml血浆

置具塞玻璃离心管中精密加入5ml

乙酸乙酯

提取溶剂充分涡旋混合3min液液萃取示意图4000rpm

离心10min后准确取出上层有机溶剂置另一干净具塞玻璃离心管置N2下水浴挥干溶剂残留物用流动相溶解离心后进样HPLC分析便于纯化与富集示例：尿液中甲基苯丙胺与苯丙胺的检测（液液萃取）取尿液2ml，置于5ml离心管中，加入5ml乙醚，涡旋，离心，取乙醚层置另一5ml离心管中，60度水浴氮气流下挥干取尿液2ml，置于5ml离心管中，加入100µl0.1mol/lNaOH，混匀后加入5ml乙醚，涡旋，离心，取乙醚层置另一5ml离心管中，60度水浴氮气流下挥干甲基苯丙胺（冰毒）苯丙胺

体液中呈阴离子状态的药物主要有磺酸类、羧酸类及代谢物葡萄醛酸苷等。

体液中能离解成阳离子的药物主要是有机胺类，尤其是季铵类药物离子对提取应用的药物固相萃取SPE是目前使用相当广泛的一种萃取方法，惜乎价格较贵将不同填料作为固定相装入小柱，药物溶液通过小柱时，药物被吸附、分配、离子交换，或其它亲和力作用，使药物及内源性物质同时被保留在固定相上，再选用适当溶剂洗脱药物的方法这方面，美国是老大分离与浓集用有机溶剂(甲醇)冲洗——洗净用水冲洗——活化上样用水或缓冲液冲洗，洗去内源性物质有机溶剂洗脱药物收集洗脱液······分离与浓集方法好价格贵固相萃取基本操作固定相C18先甲醇润湿小柱

再用水除去多余甲醇1)活化固相萃取基本操作1)活化2)上样液体样品内源性物质其他外源性物质待测药物固相萃取基本操作1)活化2)上样3)淋洗选择不同极性溶剂

依次为：水，由低到高比例的甲醇内源性物质其他外源性物质待测药物淋洗溶剂固相萃取基本操作1)活化2)上样3)淋洗淋洗的目的：除去生物样品的干扰，待测药物仍然保留在SPE柱上内源性物质其他外源性物质待测药物淋洗溶剂固相萃取基本操作1)活化2)上样3)淋洗4)洗脱100%甲醇为洗脱剂内源性物质其他外源性物质待测药物淋洗溶剂洗脱溶剂固相萃取基本操作收集洗脱液，其中含有待测药物直接进样分析

浓缩后进样分析待测药物洗脱溶剂1)活化2)上样3)淋洗4)洗脱固相萃取基本操作内源性物质其他外源性物质待测药物淋洗溶剂洗脱溶剂活化上样淋洗洗脱①固相选择样品1ml1ml规格固相1~25ml3ml规格固相②固相处理反相C18

固定相的6~10倍体积甲醇洗柱，使溶剂化

6~10倍水缓冲服液冲洗达分离状态③上样④分离用适当的弱溶剂洗涤洗去杂质，通N2干燥固相⑤洗脱待测物改变pH或极性固相萃取具体步骤（1）流速流速快，按触不充分，样品流失回收率低柱处理5~10ml·min-1

洗脱0.2~1ml·min-1（〈300mg〉

2~5ml·min-1（>300mg）（2）装样过载突破性试验已知浓度样品液

①小体积上柱→洗脱回收百分率

②加大体积→洗脱回收百分率

③绘图当回收率下降时为过载固相萃取具体步骤超滤分离法是以多孔半透膜（超滤膜）作为分离介质的一种膜分离技术，选用不同的孔径的不对称膜，即可按照分子量大小进行分离适合TDM血样分析Therapeuticdrugmonitoring缀合物的水解酶水解法酸水解法溶剂解法化学衍生法why?某些药物或者代谢产物极性大，挥发性低，或者对检测器不够灵敏，难以满足常规HPLC及GC检测的需要，因此进行衍生HowforGC?硅烷化酰化烷基化不对称化常用的烷基化试剂：碘庚烷、叠氮甲烷、氢氧化三甲基苯胺（TMAH）等；

常用的酰化试剂：乙酸酐、丙酸酐等；

硅烷化试剂：三甲基氯硅烷（TMCS）、双-三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、双-三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅咪唑（TMSI）等。why?某些药物或者代谢产物极性大，挥发性低，或者对检测器不够灵敏，难以满足常规HPLC及GC检测的需要，因此进行衍生HowforLC?UVFL非对映衍生化?化学衍生法非对映衍生化?对映体：一个化合物的两个光学异构体，其分子在整体上互为不能重叠的镜像。分子量、分子式完全相同。应用普通色谱方法难以分离。通过衍生可以使之非对映化。根据构象等理化性质差异进行分离。化学衍生法分析方法的建立方法的选择色谱分析法免疫分析法生物学方法第三节体内样品分析方法与方法验证分析方法的建立选用何种方法进行体内药物分析为好呢？一般要根据药物的理化性质、结构持征、药物浓度大小、干扰成分的多少、预处理方法、实验目的以及实验室条件等因素综合起来进行考虑。分析方法的设定依据

(一)做好文献总结、整理工作对已有报道的药物进行测定，应系统总结前人的文献，从中找出哪些问题已解决，还存在哪些问题等。对尚无文献报道的，也可根据药物的性质情况，参考相似类型药物的文献资料。(二)充分了解待测药物的特性与体内状况药物的理化性质和体内过程是建立方法的主要依据。药物的理化性质包括酸碱性(pKa)、亲脂性、溶解度、极性、光谱特征、稳定性等，这些性质与分析方法的选择、实验条件的改善密切相关。与常规分析方法不同，体内药物分析的对象是来自生物体内的样品，因此对药物在体内的状况必须了解，如药动学参数、体内代谢情况等。这涉及样品取样频率与间隔，分析方法的选择等。(三)明确测定的目的、要求应了解拟建立的方法是用于测定药代动力学参数，还是用于临床药浓监测。前者要求具有一定的灵敏度和准确度，不强调简便、快速，设计方法时应考虑到不同时间获得的样品中药物浓度变化较大这一因素。而用于临床药浓监测，则要求方法简便、快速。另外，是否要求同时测定母体药物和代谢物，若需同时测定两者，则应选择具有分离能力或专属的测定方法。

（四）结合实验室条件根据实验室现有的和可能获得的设备条件加以考虑，选择可行的方法。

方法建立的一般实验步骤

方法初步拟定后，还需进行一系列实验工作，以选择最佳实验条件及验证所拟定的方法是否适合实样检测。通常包括下列步骤：（一）以纯品进行测定取药物或其代谢物纯品适量，按拟定方法测定，求得浓度与测定响应值之间的关系，进行线性范围、最适测定浓度、检测灵敏度、测定最适条件(如pH值、温度、反应时间等）等的选择。(二)空白样品测定取空白生物样品，按拟定的方法进行处理，测定空白值(或色谱图)。空白值高低或色谱图状况将影响到方法的灵敏度和专属性，应力求将空白值降低。在色谱分析中应力求减少体内样品中内源性杂质峰，对无法消除的内源性杂质峰应设法使其从待测物的色谱区域内移开。能否取得良好的样品空白实验结果，是决定测定方法实际可行性的重要环节，必须设法解决。

(三)以水代替空白样品，添加标准后测定以水代替空白生物样品，添加标准后按拟定的方法进行测定，以了解提取回收率及最低检测浓度的大致情况，从而对萃取溶剂、pH值、挥发浓缩等条件进行选择。(四)空白样品中添加标准后测定于空白生物样品中添加一定量标准品后按拟定方法进行测定，求得样品回收率数据，建立标准曲线。若采用色谱法测定，多数情况下需要用内标法定量，则应首先选择合适的内标，然后进行回收率的测定。

(五)体内实际样品测定经过上述(一)至(四)步骤后进行实际样品的测定。但要指出的是，以上步骤只是生物样品实样检测前的准备工作，不能完全确定是否适用于实样测定。因药物在体内变化是复杂的，如不注意药物代谢和蛋白结合情况，则应用体外建立的方法，进行体内实样测定时往往会失败，甚至导致错误的结论，所以在设计方法时强调对药物体内过程要有一定程度的了解，从而选择避免干扰和适合样品实际情况的方法。有时也可采用专属性强，已证明用于体内实样测定的步骤和方法作为对照测定，以此来检验所建立的方法的实际可行性。

分析方法的建立方法

的验证特异性标准曲线与定量范围定量下限准确度与精密度稳定性回收率分析过程的质量控制未知样品浓度超出范围的处理相关物质测定其它方法验证验证的效能指标与基本要求

1．特异性——内源性物质不得干扰原药、代谢物 2．标准曲线与线性范围——r≥0.9900，至少5个浓度，不许外延 3．准确度——与实际状况相符 4．精密度——结果可重现 5．定量限——达到峰浓度的1/10～1/20,3~5倍t1/2， 6．稳定性——确保所有样品准确测定 7．提取回收率——一般低于100％，须稳定(一)特异性

比较标准物质与6个不同个体的空白生物介质和QC样品软电离质谱(LC-MS)介质效应比较QC样品和至少6个不同个体用药后的实际样品必要时LC-DAD/MS确证峰的单一/同一

比较待测药物,同服药物,待测药物的QC样品和添加有同服药物的干扰样品特异性(specificity),又称专属性或专一性,通常与选择性(selectivity)互用1.内源性物质2.未知代谢物

3.伍用药物4.参比方法参比方法横坐标(x),拟定方法纵坐标(y),最小二乘y=a+bx

a恒定干扰b比例干扰(如,标记抗原不纯,交叉免疫)(二)标准曲线与定量范围1.标准曲线的建立(二)少数方法(如,IA)外,通常为线性模式

线性回归:最小二乘法或加权最小二乘法自变量(x)为药物浓度,因变量(y)为响应信号强度(1)系列标准溶液:

n≥6(不包括0点);等比系列(2~3); 通常为100~1000倍(2)内标溶液:

浓度相当于系列标准溶液的几何平均浓度

(3)系列标准样品:空白生物介质,加入系列标准溶液(4)标准曲线的绘制:药物浓度,以单位体积(如血浆)或质量(如肝脏)的生物介质中加入标准物质的量表示(二)标准曲线与定量范围2.限度要求通常用至少6个浓度建立标准曲线非线性相关(如IA)可能需要更多浓度点定量范围覆盖全部待测样品浓度范围定量上限(ULOQ)高于用药后的峰浓度(Cmax)定量下限(LLOQ)低于Cmax的10%~5%(1/10~1/20)标准曲线各浓度点的回归计算值(x’)与标示值(x)之间的偏差〔bias=[(x’-x)/x]×100%〕在可接受的范围之内最低浓度点的偏差在±20%以内其余浓度点的偏差在±15%以内(三)定量下限1.测定法取同一生物介质,制备至少5个独立的标准样品,其浓度应使信噪比(S/N)大于5,依法进行精密度与准确度验证定量下限(LLOQ):标准曲线上的最低浓度点符合准确度和精密度要求2.限度要求准确度应在标示浓度的80%~120%范围内,相对标准差(RSD)应小于20%(四)精密度与准确度1.测定法高中低3个浓度的QC样品,制备至少5个独立的样品低:LLOQ的2~3倍;高:ULOQ的80%;中:几何平均浓度同法独立测定3天

方法精密度除评价批内(日内)RSD外,同时还应评价批间(日间)RSD2.限度要求准确度:低,80%~120%; 中高,85%~115%RSD:低,20%; 中高,15%(五)稳定性1.测定法(高低浓度)室温考察1个工作日(如1,2,4,8或24h)

冷藏(4℃)数个工作日(标准储备液至整个分析完成)冷冻(-20℃/-80℃)至整个分析完成冻-融至少经历3个循环

短期稳定性:在1个分析批内,样品室温等待处理;处理后溶液在特定(HPLC进室)温度等待进样期间稳定性长期稳定性:在整个样品分析期间,体内样品的长期储藏,冻融;以及标准储备液的稳定性2.期限要求短期:通常1工作日,不超过3工作日;长期:整个分析完成期限(六)提取回收率1.测定法高中低3个浓度的QC样品,制备至少5个独立的样品另取空白生物介质,照QC样品同法处理,加入等量的标准溶液(必要时除去溶剂)同法处理高中低3个浓度的标准对照样品(不含生物介质)样品处理方法的评价重点在于结果的精密与重现;而非待测物提取的完全与否2.限度要求RSD:低,20%; 中高,15%(七)分析过程的质量控制每个未知样品测定一次,必要时进行复测来自同一个体的体内样品在同一分析批中测定每个分析批,建立批标准曲线;并随行3浓度QC样品

QC样品每个浓度至少双样本,并均匀分布在未知样品顺序(低→高/高→低顺序均匀穿插整个分析批)中一个分析批内未知样品数目较多时,应同时增加各浓度QC样品数,使QC样品数大于未知样品总数的5%QC样品测定结果的偏差不大于±15%,低浓度点偏差不大于±20%;允许1/3非同浓度QC样品结果超限不符合上述要求,则该分析批样品测试结果作废(八)未知样品浓度超限的处理标准曲线不能外延,浓度超限的样品处理后再测定浓度高于ULOQ部分样品用空白生物介质稀释至规定体积再测定同时制备浓度高于ULOQ的QC样品,同法稀释(浓度不低于LLOQ)后测定浓度低于LLOQ增加样品体积(制备样品浓度高于LLOQ);同法进行QC样品和空白介质试验特异性不降低,准确