氨溴索对环丙沙星透过铜绿假单胞菌生物膜的影响

氨溴索对环丙沙星透过铜绿假单胞菌生物膜的影响【摘要】目的研究氨溴索对环丙沙星透过铜绿假单胞菌生物膜的影响。方法孔径为μm的医用微孔滤膜建立铜绿假单胞菌生物膜的体外模型；用高效液相色谱(HPLC)方法测定环丙沙星透过生物膜的量，并测定在2和/ml氨溴索作用后环丙沙星透过细菌生物膜的量。结果经过7d的连续培养后，铜绿假单胞菌可在微孔滤膜上形成均匀致密的生物膜。环丙沙星可缓慢透过细菌生物膜，8h左右达到平衡；2和/ml氨溴索作用后可以明显增加环丙沙星8h内透过生物膜的量。结论以医用微孔滤膜为载体可建立铜绿假单胞菌生物被膜体外模型；氨溴索可以显着地促进环丙沙星对细菌生物膜的透过。

【关键词】细菌生物膜环丙沙星氨溴索铜绿假单胞菌渗透限制

Effectofambroxolonpermeabilityofciprofloxacinacross

ABSTRACTObjectiveToinvestigatetheeffectofambroxolonthepermeabilityofciprofloxacinacrossthebacterialbiofilmofPseudomonasaeruginosa.MethodsInvitromodelofbiofimusingμmporediametermedicalmicroporefilmwasestablished.TheamountsofciprofloxacinacrossthebacterialbiofilmwasmeasuredbyHPLCunderdifferentcircumstances:physiologicalsaline,2mg/mland/mlambroxol,andclarithromycinwasusedaspositivecontrol.ResultsAftercontinuoussevendaycultivation,couldformcompactandwelldistributedbiofilmonthesurfaceofmicroporefilm.Ciprofloxacincouldslowlypermeatethroughthebiofilmandequilibrationwasachievedin8h.Whencombinedwithambroxol,thepermeabilityrateofciprofloxacinsignificantlyincreased.ConclusionsInvitromodelofbiofilmwassuccessfullyestablishedusingmedicalmicroporefilmasasupporter,andambroxolcansignificantlypromotethepermeabilityofciprofloxacinacrossthebacterialbiofilmofPseudomonasaeruginosa.

KEYWORDSBacterialbiofilm;Ciprofloxacin;Ambroxol;Pseudomonasaeruginosa;Penetrationlimitation

细菌生物膜(biofilm，BF)是一个具有结构性、协调性和功能性的高度组织群体，BF菌生物学特性与浮游菌显着不同，其环境适应能力更强，可抵抗吞噬细胞作用，逃避宿主免疫，故耐药性极强，使BF相关感染的临床治疗变得非常棘手。在BF细菌的耐药机制中，渗透限制显得尤为重要。由于BF的特殊结构，使抗生素难以渗透，导致只有BF表面的细菌暴露于有效剂量的抗生素中，而BF深层的细菌难以被杀灭，这也是临床上BF感染难以治愈或迁延反复的原因之一。国外有报道，化痰药N乙酰半胱氨酸干扰生物膜形成，破坏生BF结构的作用［1］，被认为是一种具有抗菌性质的非抗生素药物。氨溴索(商品名：沐舒坦)是临床治疗中常用的化痰药物之一，与N乙酰半胱氨酸作用机制上有一定的相似性，但它是否具有破坏BF结构，增加药物渗透的作用还不确切。本实验在建立体外BF模型的基础上，探讨氨溴索对喹诺酮类抗生素环丙沙星透过BF的影响，为临床上选择氨溴索作为抗生素治疗的辅助药物提供实验依据。

1材料

药物

氨溴索标准品(批号20051011)、盐酸环丙沙星标准品(批号30451200302)和克拉霉素标准品(批号20040613)均由中国药品生物制品检定所提供。

BF载体及模型材料

μm的医用微孔滤膜(上海兴亚净化材料厂)，直径1cm高的玻管(重庆医药集团股份有限公司订做)。

受试菌株

铜绿假单胞菌PAO1菌株为本实验室保存。

主要试剂

乙腈色谱纯(天津市大茂化学试剂厂，批号20051119)；磷酸分析纯(批号20050907)和三乙胺色谱纯(批号20041105)均为成都市科龙化工厂产品。

仪器

津岛LC2010A高效液相色谱系统，NC2000色谱工作站，SPD10A型紫外可见分光光度检测器。

2方法

体外BF模型的建立［2］

用孔径为μm的医用微孔滤膜封闭直径为1cm的玻管一端。玻管无菌处理后，滤膜端向下置于24孔板中。向玻管中加入500μl菌液和一定量LB培养基，24孔板的每孔内加入适量培养基，使液面与玻管内液面相平，37℃连续培养7d后，每个玻管内加入相应药物，作用不同时间取样，以HPLC测定24孔板中每孔玻管外的环丙沙星浓度。

滤膜上BF的鉴定［3］

加药前随机抽取3孔，用银染法鉴定滤膜上BF形成的情况。

最低抑菌浓度(MIC)的测定

采用微量稀释法测定环丙沙星、克拉霉素对PAO1菌株的MIC。

用HPLC法测定LB培养基中环丙沙星的浓度［4］

(1)色谱条件色谱柱：AlltechAlltimeC18(150mm×，5μm)，柱温35℃；流动相：稀磷酸∶乙腈为87∶13(三乙胺调节pH至±)；检测波长278μm，流动相流速/min。理论板数按盐酸环丙沙星峰计算不低于2000，盐酸环丙沙星峰与相邻杂质峰的分离度符合规定。

(2)标准品溶液的配制精密称取于105℃干燥至恒重的盐酸环丙沙星标准品适量(相当于环丙沙星40mg)溶于100ml容量瓶中，加LB培养基溶解至刻度，摇匀；精密量取1、2、4、6和8ml置100ml容量瓶中，加LB培养基溶解至刻度，摇匀，即得不同浓度的系列环丙沙星标准品溶液(、、、和/ml)。

(3)样品预处理精密吸取样品500μl于EP管中，加入乙腈1000μl，涡旋30s，离心5min(10000r/min)，取上清液20μl进样分析。

(4)精密度试验按照标准品溶液配制方法配制低、中、高三种浓度(、、/ml)的环丙沙星LB溶液，按样品预处理方法进行预处理，分别于1d内和1周内加样检测6次，以求得日内和日间标准偏差。

(5)回收率试验按照标准品溶液配制方法配制低、中、高三种浓度(、、/ml)的环丙沙星LB溶液，按样品预处理方法处理后加样进行HPLC检测，计算回收率。

3结果

BF银染鉴定结果

滤膜经银染后，肉眼可见膜表面呈灰黑色着色，色泽均匀、致密，表明滤膜表面有铜绿假单胞菌BF形成。

环丙沙星及克拉霉素对PAO1的MIC

结果见表1。

HPLC测量孔内渗出环丙沙星量的结果

(1)HPLC测定环丙沙星浓度的标准曲线结果见图1。标准曲线回归方程为

y=6741+3439513xr=

在～/ml范围内线性良好。最低检测浓度为/ml。

(2)HPLC环丙沙星精密度的考察结果见表2。

(3)HPLC环丙沙星回收率的考察结果见表3。

上述实验结果表明，该HPLC色谱条件可用于LB溶液中环丙沙星浓度的检测。

(4)环丙沙星透过生物膜的速度体外生物膜模表1环丙沙星及克拉霉素对PAO1的MIC表2不同浓度的环丙沙星日内和日间精密度表3不同浓度的环丙沙星回收率型建立后，向玻管内加入环丙沙星至终浓度20μg/ml，分别在0、2、4、6、8、10和12h取样，动态观察渗出的环丙沙星浓度依次为0、(±)、(±)、(±)、(±)、(±)和(±)μg/ml(n=6)。结果显示，环丙沙星可以缓慢的透过生物膜，其浓度随时间而增加，在8h左右达到平衡。(5)氨溴索对环丙沙星透过生物膜的影响结果见表4。表4氨溴索对环丙沙星透过细菌生物膜的影响结果表明，空白组可见一定量的环丙沙星透过生物膜，随着环丙沙星浓度的升高，透过BF的环丙沙星量增加。加入氨溴索2mg/ml后，透过生物膜的环丙沙星量有明显的增加，与空白组相比()有显着性差异。加入低浓度的氨溴索/ml，透过生物膜的环丙沙星量与空白组相比也有明显增加()，有显着性差异，但增加不及高浓度氨溴索2mg/ml组。氨溴索2mg/ml组透过的环丙沙星量除环丙沙星10μg/ml组外，均与克拉霉素阳性对照组相似，无显着性差异。

4讨论

已有很多研究报道胞外多糖复合物形成分子屏障和电荷屏障(大多带负电荷)可阻止或延缓某些抗生素的渗入，固定在BF基质中一些抗生素水解酶［5］也可促使进入BF的抗生素灭活［6］。近年来，细菌BF相关感染已成为临床上常见的感染类型。由于细菌BF本身的生理结构特性以及某些医疗器材(如气管内插管的导管)本身的非通透性，使抗生素的渗透成为治疗BF相关感染的一大难题。条件致病菌铜绿假单胞菌导致慢性难治性感染的原因就是因为铜绿假单胞菌以BF形式存在，而BF的特殊结构可以保护细菌逃避机体的免疫机制，并且BF的渗透限制还可以避免深层细菌接触有效浓度的抗生素［7］，使感染迁延不愈。因此解决细菌BF对抗生素的渗透限制问题，对临床上细菌BF感染的治疗将有很大帮助。

本实验利用医用微孔滤膜为载体，构建了细菌BF的体外模型，为研究细菌BF的渗透性提供了很好的实验平台。藻酸盐是铜绿假单胞菌BF胞外多糖的主要成分，胞外多糖对细菌的渗透限制起重要作用。克拉霉素作为十四元环的大环内酯类抗生素，已有报道它对BF通透性好，能抑制藻酸盐形成，破坏BF结构进而减少细菌BF的渗透限制［8］，故该实验选择克拉霉素1×MIC作为阳性对照。从实验结果可以看出，在高浓度氨溴索(2mg/ml)作用下，环丙沙星渗出BF的量较空白组有明显增加，与阳性对照组相比差别没有显着性，说明该浓度的氨溴索作用与克拉霉素相似。临床上，氨溴索作为常用的化痰药，它可以使痰液变稀薄，纤毛运动加强使痰液易咳出，近年来有报道氨溴索不仅具有祛痰的作用，还可以增加氨苄西林/舒巴坦向肺部转运，增加氨苄西林/舒巴坦的杀菌作用［9］。本实验证明对呼吸道细菌BF感染的患者使用氨溴索，不光可以易化痰液的咳出，对抗生素渗透入细菌BF也将有很大帮助，可作为临床上治疗BF相关感染的辅助用药。

测定生物样品中环丙沙星浓度的HPLC法，国内外已有报道［10，11］。本法采用乙腈为蛋白沉淀剂，直接沉淀蛋白后进样，简单易操作。优化流动相，对考察LB培养基中的环丙沙星浓度适用。

氨溴索增加BF对抗生素的渗透的机制，可能与其抑制细菌胞外多糖的形成有关，本课题组正在对此作进一步研究。

【参考文献】

［1］OlofssonAC,HermanssonM,ElwingH.NacetylLcysteineaffectsgrowth,extracellularpolysaccharideproduction,andbacterialbiofilmformationonsolidsurfaces［J］.ApplEnvironMicrobiol,2003,69(8):4814

［2］裴斐，王睿.抗藻酸盐血清对粘液型铜绿假单胞菌粘附性和生物被膜渗透性的影响［J］.中国临床药理杂志，2001，17(6)：423

［3］PassarielloC,BerluttiF,SelanL,etal.Arapidstainingproceduretodemonstrateglycocalyxproductionandbacterialbiofilms［J］.Microbiologica,1994,17(3):225

［4］蔡爽，冯婉玉.高效液相色谱法测定人血浆中环丙沙星的血药浓度［J］.山西医药杂志，2005，34(5)：422

［5］GiwercmanB,JensenET,CostertonJW.InductionofβlactamaseproductioninPseudomonasaeruginosabiofilms［J］.AntimicrobAgentsChemother,1991,35(5):1008

［6］StewartPS.Theoreticalaspectsofantibioticdiffusionintomicrobialbiofilms［J］.AntimicrobAgentsCh