沙苑子黄酮对MCF

沙苑子黄酮对MCF【摘要】目的研究沙苑子总黄酮(FAC)对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制作用、诱导凋亡作用以及其对NF-кB表达作用影响。方法以不同浓度(，，，5mg/ml)处理MCF-7细胞6，12，24，48，72h后，SRB法测定细胞增殖抑制；FITC-AnnexinⅤ/PI双染法检测凋亡率变化；用Westernblot法检测NF-кB蛋白表达。结果SRB法显示，，mg/ml浓度沙苑子黄酮作用24，4872h以及mg/ml作用48，72h后MCF-7细胞增殖抑制作用与对照组相比差异具有显着性；5mg/ml作用48，72h后以及mg/ml作用24h后对MCF-7的增殖抑制作用与对照组相比也有差异性。FITC-AnnexinⅤ/PI双染法FCM检测显示，不同浓度沙苑子黄酮(，，，5mg/ml)作用72h后，MCF-7细胞早期凋亡率分别为%，%，%，%,晚期凋亡率分别为%，%，%，%。与对照组比较，，mg/ml组早、晚期凋亡率差异具有显着性，5mg/ml组的早、晚期凋亡率也有差异性，mg/ml剂量组的早、晚期凋亡率与5-Fu组比较差异无显着性。Westernblot检测NF-κB表达，再用BandLeader分析。结果，，/ml浓度组与对照组相比NF-кB表达减少差异具有显着性；5mg/ml组与对照组相比NF-кB表达也有差异性。结论沙苑子黄酮对MCF-7具有增殖抑制和诱导凋亡作用；其作用可能与其下调NF-кB表达有关。

【关键词】沙苑子总黄酮；MCF-7；NF-кB；5-Fu；凋亡

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，初氏［1］与石氏［2］对北京西城区近四年的居民疾病死因分析显示，居民死亡的第1位原因是恶性肿瘤，而乳腺癌居女性恶性肿瘤死亡原因的第3位。上海地区2002～2005年乳腺肿瘤是第1位死因。乳腺癌与其他恶性肿瘤一样，药物治疗不良反应比较严重，甚至有些癌症病人最后死于药物的不良反应而不是疾病本身。因此，寻找一种对乳腺癌有效，而不良反应比较小的药物是十分有意义的。中医中药是世界医药宝库中的瑰宝，有很多值得我们探讨研究，也是药物开发的不竭的宝库。前期研究显示，沙苑子黄酮对S180荷瘤小鼠以及H22荷瘤小鼠的肿瘤均有增殖抑制作用［3，4］。本文用SRB法研究MCF-7对沙苑子黄酮的敏感性；FITC-AnnexinⅤ/PI双染法FCM法研究沙苑子黄酮对MCF-7诱导凋亡作用；用Westernblot法检测NF-kB的表达，探讨沙苑子黄酮对人乳腺癌细胞株的作用，以期能为乳腺癌的治疗开辟一条新的途径。

1材料与仪器

药物沙苑总黄酮由苏州中药研究所顾振纶教授提供,比色法检测质量分数为80%。RPMI1640培养基、MEM培养基，Gibco产品；超级新生小牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所生产。PMI1640培养基稀释成浓度为以mg/ml，4℃保存备用。

细胞株人乳腺癌细胞株MCF-7，购于中科院上海细胞生物研究所(中国上海)。

其它试剂FITC-AnnexinⅤ/PI双染试剂盒(Medsystems,Austria)；兔抗NF-κBp65多克隆抗体、批号为J119，购自SantaCruz公司；Biotinylated兔抗羊IgG自北京中山生购物技术有限公司；胰酶，AMRESO产品；胰岛素，上海第一生化药业有限公司生产；SRB,上海化学试制公司进口分装、L-谷氨酸、碘化丙啶，Sigma产品；十二烷基磺酸钠，上海化学试剂厂生产；其余试剂均为国产分析纯。

仪器

CO2孵箱，Napco5410型，美国Napco公司；倒置显微镜，XD-20型，重庆光学仪器厂产品；酶联免疫检测仪，DG3002型，国营华东电子管厂产品；流式细胞仪；电热恒温水浴锅，型，上海医疗器械厂产品；光栅分光光度计，722型，江苏科达智能仪器厂产品。

2方法

细胞培养用含10%FBS、200U/L胰岛素的MEM培养液于37℃、5%CO2条件下培养，3d传代。取对数生长期细胞进行实验。以1×106/ml的细胞浓度，分别接种于含FAC浓度为，，，5mg/ml的RPMI1640培养体系中,置于37℃、5%CO2条件下培养，24h后收集细胞，以1×PBS洗涤2次并重悬细胞,备用。

SRB法测定细胞活力［5，6］取生长期MCF-7细胞接种于96孔培养板中，调整细胞浓度为4×105/孔,次日进行分组。实验组分为不同浓度FAC，阴性对照组加入等体积培养液,阳性对照组加5-Fu，每组均设4个平行孔。分别置37℃、5%CO2条件下培养培养，分别于6，12，24，48，72h后每孔加入预冷的80%三氯醋酸50μl使TCA终浓度为10%，固定h,加TCA时必须轻轻地加在培养液的表面，静置5min后再将平板移至4℃放置1h，倒掉固定液，去离子水洗5遍后,晾干；每孔加入100μl的SRB，室温放置15min，1%醋酸洗5次,晾干；加入10mmol/LTris液150μl，振荡2min以溶解SRB。用酶标仪在波长531nm处测定A值。计算肿瘤细胞增殖抑制率(IR)。

增殖抑制率=［/A对照组］×100%

双染法流式细胞术检测凋亡细胞率［7］采用FITC-AnnexinV/PI双染法FCM检测MCF-7细胞凋亡:4℃，1×PBS洗涤细胞2次，调整细胞浓度至5×105/ml，每100μl细胞悬液加入FITC-AnnexinV5μl和PI染液μl，轻轻混匀，避光置冰上反应10min，入400μl1×PBS，混匀，备用。

用Westernblot法检测NF-кB蛋白表达并进行定量分析［8］MCF-7细胞经不同浓度沙苑子黄酮分别处理24，36，48，72h后，用传统Westernblotting方法［7］检测NF-кB表达，并用BandLeader分析所得的结果。

数据处理数据以±s表示，采用软件进行单因子方差分析处理，组间采用Dunnett方法比较。

3结果

抑制MCF-7细胞增殖SRB法显示，，，，5mg/ml浓度的沙苑子黄酮作用后，，mg/ml浓度沙苑子黄酮作用24，48，72h以及mg/ml作用48，72h后MCF-7细胞增殖抑制率与对照组相比差异具有显着性；5mg/ml作用48，72h后以及mg/ml作用24h后对MCF-7的增殖抑制作用与对照组相比也有差异性。结果见表1及1。表1不同剂量的FAC作用于MCF-7不同时间后对细胞的增殖作用的影响(略)

流式细胞术检测细胞凋亡率FITC-AnnexinⅤ/PI双染法FCM检测显示,不同浓度的FAC诱导MCF-7细胞发生凋亡,在一定范围内呈浓度依赖性,随药物浓度的增加,细胞凋亡率增加。FITC-AnnexinⅤ+/PI-细胞为正常活力细胞,FITC-AnnexinⅤ+/PI-细胞为早期凋亡细胞,FITC-AnnexinⅤ-/PI-细胞为晚期凋亡和死亡细胞。，，，mg/ml沙苑子黄酮作用MCF-7细胞72h后细胞早期凋亡率分别为%，%，%，%，晚期凋亡率分别为%，%，%，%。，，mg/ml各组与对照组比较差异均有统计学意义()；5mg/ml组作用72h后对MCF-7的诱导凋亡率与对照组比较也有差异性()。结果见图2。

与对照组比较,**，差异具有显着性；

与对照组比较，*,具有差异性

Westernblot研究结果提示NF-κB表达减弱MCF-7细胞经不同浓度沙苑子黄酮分别处理24，36，48，72h后NF-κB蛋白的表达量呈下降趋势，而且这种下降趋势与作用时间以及药物浓度成依赖关系。结果见图3。根据前面的实验选取作用比较强的时间点72h作为作用点，以不同浓度沙苑子黄酮分别作用MCF-7，72h后用Westernblot法检测NF-κB表达情况。再用BandLeader软件分析，结果显示，5，，，mg/ml浓度组与对照组相比NF-кB表达减少差异具有显着性，5mg/ml组与对照组相比NF-кB表达也有差异性。见图4。

4讨论

沙苑子为豆科植物扁茎黄芪Astragaluscomplanatus干燥成熟的种子，性温味甘，归肝、肾，始见于《临证指南医案》,曾以白蒺藜、沙苑蒺藜、沙苑白蒺藜、潼蒺藜等名称收入历代诸家本草。沙苑子具有温补肝肾，固精，缩尿，益肝明目的功能。自20世纪80年代开始,有不少药学者对沙苑子进行了较为集中的研究，并发现其对循环系统、肝、肾、免疫系统等有一定的药理作用［9,10］。沙苑总黄酮是沙苑子的乙醇提取物，主要成分是黄酮。先前的药理研究表明：沙苑子黄酮具有改善血液流变学指标、抗肝纤维化、诱导白血病细胞凋亡、调节免疫功能等作用［2,3］。根据中医理论认为：乳腺癌的发病与肾虚有一定关系，而沙苑子黄酮具有益肾的作用。因此，本文推测沙苑子黄酮具有抗乳腺癌的作用，以人乳腺癌细胞株MCF-7作为研究对象，探讨沙苑子黄酮对人乳腺癌的作用及其机制。

近年来研究表明［11～13］,核转录因子кB(nuclearfactor-кB,NF-кB)是一种重要的转录因子蛋白,对多种基因表达上调起关键作用，在肿瘤的发病机制中发挥重要作用。NF-кB有抑制细胞发生凋亡的作用,而许多抗肿瘤药的作用机理正是诱导了肿瘤细胞凋亡。沙苑子黄酮作用之前，MCF-7细胞中NF-кB表达呈阳性,主要定位于癌细胞的细胞核中；沙苑子黄酮作用之后，NF-кB阳性的表达显着降低,主要定位于MCF-7细胞的胞质。因此沙苑子黄酮具有抑制NF-кB在MCF-7种表达的作用，因此可以诱导细胞凋亡。

本文首先通过SRB法筛选法，确定对MCF-7增殖抑制作用最佳浓度梯度以及最佳时间点。再用最佳浓度梯度和作用时间点处理MCF-7细胞，检测细胞凋亡、凋亡相关基因以及蛋白表达。结果显示，沙苑子黄酮对MCF-7具有明显的增殖抑制作用，最高增殖抑制率达到%。沙苑子黄酮具有显着的诱导MCF-7凋亡的作用，早期凋亡率达%，晚期凋亡率为%。通过最佳作用浓度沙苑子总黄酮作用有效时间后，NF-κB表达与浓度梯度及作用时间呈负相关。令人感兴趣的是这种基因表达结果正好与流式细胞分析结果相吻合，提示沙苑子黄酮作为治疗乳腺的药物之一，值得进一步研究。

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